丁宏偉，李志香，蔡云飛

（齊魯師范學院生物系，山東濟南 250013）

南瓜是葫蘆科植物南瓜的果實，具有生長強健，對環(huán)境適應性強、產量大、抗病蟲害能力強、營養(yǎng)全面等特點，一般不需使用農藥，少有污染，因此在我國南北方廣為種植。南瓜的果肉富含多種氨基酸、維生素、多糖、果膠、礦物質，還含有類胡蘿卜素等多種生物活性物質。南瓜多糖是其活性成分中最重要、最具潛力功能因子之一[2]，并對糖尿病癥狀有顯著的治療效果[3]。因此，對南瓜進行深加工，提取其南瓜多糖有著重要的經濟效益。

目前，南瓜多糖常用的提取方法一般為熱水浸提法，但此方法效率低，操作時間長。很多學者致力于尋找高效、快速、簡易的南瓜多糖提取方法。本研究采用微波輔助超聲波提取南瓜多糖，在單因素試驗基礎上，運用正交試驗研究了微波處理時間、超聲波處理時間及超聲處理溫度對多糖提取率的影響，優(yōu)化了提取工藝，同時研究了提取的多糖的抗氧化性質，為今后南瓜的加工工藝及抗氧化活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市售潔凈、成熟南瓜；苯酚，葡萄糖，硫酸，無水乙醇，水楊酸，濃鹽酸，過氧化氫，蒽酮，七水硫酸亞鐵，鄰苯三酚，1，1－二苯基－2－三硝基苯肼等，化學試劑均為分析純；722s型分光光光度計：上海精密科學儀器有限公司；752pc紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；101－3－s電熱恒溫鼓風干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；DS－1高速組織搗碎機：上海精密儀器儀表有限公司；CR20BZ型高速離心機：日立公司；81－2型恒溫磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；超聲波清洗儀KQ100DB（超聲頻率40 kHz，超聲功率100 W）：上海越眾儀器設備有限公司；格蘭仕微波爐G80F20CSLB8（S0）（微波頻率 2450 MHz，功率 800 W）：格蘭仕；電子恒溫水浴鍋：國華電器有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 南瓜多糖的熱水浸提法[4]

將南瓜洗凈切塊，打漿，稱取100 g，按料液比1∶4（g/mL）加入蒸餾水，置于 75℃～85℃水浴中 6 h，過濾收集濾液，慮渣再次加入1倍南瓜的水，相同溫度提取6 h，過濾收集濾液，將兩次所得抽提液混合濃縮。濃縮液經脫脂、脫蛋白和脫色后，于離心機中以4 000 r/min離心20 min，去除沉淀，將上清液與95%乙醇作用，靜置2 h，于4 000 r/min離心20 min，將沉淀相繼用丙酮、乙醚洗滌，真空干燥，即得多糖樣品，測定其多糖含量。

1.2.2 南瓜多糖含量測定[5]

總糖含量采用蒽酮－硫酸法測定；還原糖含量采用3，5－二硝基水楊酸比色法（以葡萄糖為標準品）。多糖含量＝總糖－還原糖含量。多糖提取率＝c×100%/m。式中：c為多糖含量；m為提取所用南瓜的質量。

1.2.3 南瓜多糖抗氧化性測定

1.2.3.1 清除羥基自由基（·OH）能力的測定[6]

反應體系中加入2 mL濃度為9 mmol/L的硫酸亞鐵，2mL濃度為9mmol/L的水楊酸－乙醇混合液和不同濃度的樣品3mL，2mL濃度為8.8mmol/L的過氧化氫，不同濃度的多糖樣品3mL，啟動反應，37℃反應1h，以蒸餾水為參比，在波長510 nm下測量各試樣的吸光度，以2 mL的9 mmol/L硫酸亞鐵，2 mL的9 mmol/L水楊酸－乙醇和2 mL蒸餾水為待測溶液的本底吸光度。

羥基自由基清除率＝[A0－（Ax-Ax0）/A0]×100%

式中：A0為對照，不加南瓜多糖，Ax為某濃度時的吸光值，Ax0為無顯色劑時的該濃度的本底值。

1.2.3.2 清除超氧陰離子自由基（O2－·）能力的測定[7]

取 0.05 mol/L pH 8.2的 Tris－HCl緩沖液 4.5 mL，置于25℃水浴中預熱，分別加入0.1 mL不同濃度的南瓜多糖樣品液和0.4 mL濃度為25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，反應4 min，加入濃度8 mol/L濃鹽酸終止反應，在波長290 nm下測定吸光度（Ai），空白組以同等體積的蒸餾水代替樣品液，吸光度A0。

超氧陰離子自由基清除率＝[（Ai－A0）/A0]×100%。

1.2.3.3 DPPH自由基清除作用的測定[8]

取不同濃度的糖溶液1.5 mL，加入0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液3 mL，混勻后25℃靜置20 min后在517 nm處測吸光度值。以蒸餾水代替樣品作為空白，以酒精溶液代替DPPH－乙醇溶液作為對照。

DPPH自由基清除率＝[1－（Asample－Acontrol）/Ablank]×100%

1.2.4 試驗設計

取料液比為1∶4（g/mL）的南瓜漿液，經微波爐處理 1、2、3、4、5 min 后，過濾收集濾液，慮渣再次加入 1倍南瓜的水，75℃～85℃水浴中提取2 h，按上述步驟處理后測定多糖含量，確定微波處理時間對多糖提取率的影響；將1∶4（g/mL）的南瓜漿液置于超聲波清洗儀中（室溫）處理 5、10、15、20、25、30 min，過濾收集濾液，按上述步驟處理后測定多糖含量，確定超聲處理時間對多糖提取率的影響；分別將1∶4（g/mL）的南瓜漿液經 30、40、50、60、70、80 ℃的超聲波處理 5 min，過濾收集濾液，按上述步驟處理后測定多糖含量，確定超聲處理溫度對多糖提取率的影響。

根據單因素試驗結果，對微波處理時間、超聲波處理時間及溫度3個因素分別選擇3個水平，進行正交試驗，確定最佳的處理條件。將最佳處理條件下提取的南瓜多糖配制成 1、2、3、4、5 mg/mL濃度，測定其抗氧化性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 微波處理時間對南瓜多糖提取率的影響

實驗前測得傳統熱水浸提法（料液比1∶4，提取溫度75℃～85℃，提取時間12 h）對南瓜多糖的提取率為2.02%，將南瓜漿液經微波爐分別處理1、2、3、4、5 min后，過濾收集濾液，濾渣再次加入1倍南瓜的水，75℃～85℃水浴中提取2 h，處理后測定多糖含量，結果見圖1。

從圖1可以看出，由于微波處理后熱水浸提時間比傳統法短，因此在微波處理1 min～2 min時，多糖的得率較傳統長時間熱水浸提法的得率少，當超聲時間2 min以上時，微波結合短時間熱水浸提法的效果較傳統浸提法明顯提高，在微波處理時間3 min～4 min時，多糖得率變化緩慢，當微波處理時間超過4 min，多糖得率開始緩慢下降，可能是由于微波處理對南瓜多糖起到了破壞作用。因此，微波處理時間以不超過4 min為好。

圖1 微波處理時間與多糖得率的關系Fig.1 Relation between microwave treatment time and extraction rate of pumpkin polysaccharide

2.1.2 超聲波處理時間對南瓜多糖提取率的影響

將1∶4（g/mL）的南瓜漿液置于超聲波清洗儀中（室溫）處理 5、10、15、20、25、30 min，過濾收集濾液，處理后測定多糖含量，結果見圖2。

圖2 超聲處理時間與多糖得率的關系Fig.2 Relation bebtween ultrasonic wave treatment time and extraction rate of pumpkin polysaccharide

從圖2可以看出，隨著超聲處理時間的延長，南瓜多糖得率增大。在超聲處理25 min以下時，南瓜多糖得率增加迅速，當超聲處理25 min時，多糖得率達到2.83%，比傳統熱浸法提高41%，效果明顯，當超聲處理超過25 min時，多糖得率變化緩慢，因此，超聲處理以不超過30 min為宜。

2.1.3 超聲處理時的溫度對南瓜多糖提取率的影響

分別將 1 ∶4（g/mL）的南瓜漿液經 30、40、50、60、70、80℃的超聲波處理5 min，過濾收集濾液，處理后測定多糖含量，結果見圖3。

圖2 超聲處理溫度與多糖得率的關系Fig.2 Relation bebtween ultrasonic wave treatment temperature and extraction rate of pumpkin polysaccharide

從圖3可以看出，南瓜多糖提取率隨著超聲處理溫度的提高而增大，在70℃以下，隨著溫度的升高，多糖得率顯著提高，溫度高于70℃時，超聲處理溫度對多糖得率影響很小，而溫度過高一方面能耗大，另一方面可能導致多糖降解，因此，超聲處理溫度以不超過80℃為宜。

2.2 正交試驗分析

為了研究各因素的重要程度，確定3個因素同時作用時對試驗結果有無協同作用，確定出最大的南瓜多糖提取率，分別對微波處理時間、超聲處理時間及溫度取合理的3個水平，以多糖得率為指標，按正交試驗表L9（34）進行正交試驗。確定最佳的處理條件組合。

2.2.1 因素水平表

因素水平表，見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factor horizontal table

2.2.2 正交試驗結果分析

正交試驗結果分析，見表2。

由極差分析表可見，在這3個試驗因素中，超聲處理時間是最主要的影響因素，南瓜多糖提取率隨超聲處理時間延長而增大；其次是微波處理時間在3 min時最好，高于或低于該時間效果都較差；最后為超聲處理溫度，溫度越高，提取率越高。最優(yōu)的處理條件為A3B2C3，即超聲處理30 min，微波處理3 min，超聲處理溫度70℃時南瓜多糖的提取率最大。

由方差分析表3可知，本試驗的三個因素中，超聲處理時間對南瓜提取率的影響最大，其次是微波處理時間，超聲溫度的影響最小。由于最優(yōu)組合并未出現在正交表中，因此，對最優(yōu)組合A3B2C3進行3次驗證試驗，測定南瓜多糖的提取率，計算平均值，此時提取率可達3.65%，比傳統熱浸提法效率提高了80%。

表2 正交試驗結果及極差分析表Table 2 Experiment results and range analysis

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

2.3 南瓜多糖的抗氧化作用

羥基自由基被認為是毒性最強的活性氧自由基，比高錳酸鉀和重鉻酸鉀氧化性還強，對機體的破壞作用最大[9]。超氧陰離子自由基（O2·）在氧化反應中扮演著非常重要的角色，因為在反應順序上其他許多活性中間產物的形成都始于與O2·的作用。DPPH自由基是一種比較穩(wěn)定的自由基，與其他自由基評價抗氧化性的方法比較，DPPH自由基能快速的反應樣品的抗氧化活性[10]?？箟难峋哂袕姷倪€原性，在食品中被廣泛作為抗氧化劑使用，能夠顯著地清除羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基，因此，本實驗選擇抗壞血酸作為陽性對照。不同濃度南瓜多糖清除自由基的能力見表4。

由表4可見，不同濃度南瓜多糖，均對羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基具有一定的清除作用。但效果均低于抗壞血酸。在南瓜多糖濃度為4 mg/mL以下時，南瓜多糖對各種自由的清除作用相對較弱，當濃度大于4 mg/mL時，對各種自由的清除作用明顯提高，并且隨著南瓜多糖濃度的提高，清除自由基的效果越明顯。

表4 不同濃度南瓜多糖對自由基的清除作用Table 4 The scavenging effect of different density of pumpkin polysaccharide on free radical

3 結果與討論

研究發(fā)現我國廣為種植的南瓜不但營養(yǎng)豐富，而且具有保健和防病治病的功效，其中的南瓜多糖是其活性成分中最重要的功能因子，因此，對南瓜多糖的提取及其抗氧化性的研究有著重要的經濟效益。超聲及微波處理可將南瓜細胞壁粉碎，有利于多糖的溶出，南瓜多糖的溶出速度與超聲處理時間、微波處理時間及超聲處理溫度有關。隨著超聲處理時間和微波處理時間的增加，多糖提取率增大。提高超聲處理溫度可以提高南瓜多糖的溶出速度，但效果不明顯。

采用微波輔助超聲波處理可以很大程度的提高南瓜多糖的提取率。其中，超聲處理時間對多糖提取率的影響最為顯著，其次是微波處理時間，超聲處理溫度有一定程度的影響。通過正交試驗確定出最佳的處理方法，即微波時間3 min，超聲處理時間30 min，超聲溫度70℃時效果最好，南瓜多糖的提取率為3.65%，與傳統長時間熱水浸提法相比，提高效率80%，同時提取時間可以大大縮短。將最佳處理條件下提取的南瓜多糖進行抗氧化性研究，結果表明，不同濃度的南瓜多糖對自由基均有清除作用，但比抗壞血酸的抗氧化性低。在低濃度時，南瓜多糖清除自由基的作用相對較小，當多糖濃度大于4 mg/mL時，對自由基的清除作用十分顯著。

微波輔助超聲處理可以粉碎南瓜細胞壁，從而釋放細胞內物質，但是南瓜多糖的溶解過程比較復雜，微波及超聲波對細胞壁的作用機理還不是十分清除。例如南瓜多糖如何溶出，釋放的南瓜多糖的性質是否發(fā)生了變化等還有待于進一步的研究和討論。采用本文所提供的方法提取南瓜多糖收率高，且能較好的保持其生理活性。對于提取的南瓜多糖的抗氧化性研究還可以在本研究的基礎上進一步增加體內試驗，從而進一步了解南瓜多糖的生理活性。

該研究為南瓜多糖的大規(guī)模的工業(yè)生產提供科學參考。當然目前的微波和超聲設備由于其自身設計的局限性，不適宜在工業(yè)中的大規(guī)模應用，在實際應用時需要對設備進行改造，從而實現工業(yè)化生產。當然，如何實現工業(yè)化生產還存在很多問題，有待于進一步的研究和討論。

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[4]彭紅,黃小茉,歐陽友生,等.南瓜多糖的提取工藝及其降糖作用的研究[J].食品科學,2002,23(8):260-263

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