郭華，周貽兵，林野，張衛(wèi)國，汪思順

（貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州貴陽 550004）

廢棄食用油脂，因來源不同俗稱為“潲水油”、“地溝油”、“煎榨油”等，是指食品生產(chǎn)經(jīng)營單位在經(jīng)營過程中產(chǎn)生的不能再食用的動植物油脂[1]。出于利益驅(qū)使，不法分子將廢棄食用油脂經(jīng)過酸煉、脫色、過濾等加工提煉后 ，又重新以植物油的名義回流到餐飲行業(yè)中。然而，目前的國家標準食品衛(wèi)生檢測方法中無植物油中廢棄食用油脂標準分析方法[3－4]，無法對摻有廢棄食用油脂的植物油進行檢測分析。廢棄食用油脂成分復(fù)雜，加工過程中產(chǎn)生有害物質(zhì)，甚至是“三致物質(zhì)”，對人體健康造成很大危害[5－6]，因此建立廢棄食用油脂的檢測方法迫在眉睫。

目前，國內(nèi)外對廢棄食用油脂的研究工作主要集中于油脂的綜合利用方面[7－8]。關(guān)于食用油脂衛(wèi)生的研究主要是針對油脂的摻假行為，少數(shù)關(guān)于廢棄油脂檢測方法的研究也是側(cè)重于單一來源廢棄食用油脂個別指標的檢測[9－10]。本試驗以檢測油脂中動物油脂的特征性甾醇即膽固醇含量作以判斷是否為廢棄食用油脂的指標，利用反相高效液相色譜法測定廢棄食用油脂中膽固醇含量，旨在為檢測部門辨別植物油中是否摻有廢棄食用油脂提供一種準確快速的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2695型高效液相色譜儀（分離單元包括四元梯度洗脫的溶劑輸送系統(tǒng)），配2489 UV/Visible檢測器，Empower色譜管理軟件：美國沃特世公司；LABOROTA 4001標準型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國海道夫公司。

膽固醇標準儲備液：稱取0.00520g膽固醇標準品，于50 mL小燒杯中，加入少量乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用乙醇洗滌燒杯數(shù)次，將洗滌液轉(zhuǎn)入容量瓶中，用乙醇定容到50 mL，搖勻，配置成1 mg/mL的標準儲備液。

氫氧化鉀、氯化鈉、乙醚、石油醚和丙酮均為分析純，甲醇和乙醇為色譜純，水為超純水[18.25（MΩ·cm）]。

1.2 色譜條件

Waters C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為100%甲醇溶液，流量1.0 mL/min，檢測波長203 nm，進樣體積 20 μL。

1.3 方法

準確稱取1.00 g油樣于50 mL塑料離心管中，加入5 mL乙醇搖勻，再加入2 mL質(zhì)量濃度25%氫氧化鉀溶液，于100℃水浴中皂化60 min，每隔15 min振搖一次離心管，加速皂化速度。

在皂化后的離心管中加入3 mL水，少量氯化鈉，加入20 mL混合溶劑（乙醚與石油醚比例為1∶1，體積比），振搖，靜止分層，將上清液轉(zhuǎn)移到100 mL濃縮瓶中，重復(fù)萃取2次，合并上層萃取液，濃縮近干，加入乙醇定溶至5 mL，過0.45 μm的有機濾膜，上機測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 皂化條件的選擇

考察了氫氧化鉀質(zhì)量濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%對皂化的影響，結(jié)果表明：隨著氫氧化鉀濃度的增加，皂化速度加快，氫氧化鉀的濃度超過30%時，氫氧化鉀剩余較多，溶液呈黏稠狀，而氫氧化鉀濃度低于20%時，皂化速度較慢，故本實驗選擇了25%作為皂化反應(yīng)中氫氧化鉀的濃度。

在皂化時，加入乙醇目的是溶解油樣，增大樣品與氫氧化鉀的接觸面積，加速皂化速度。考察了乙醇加入量分別為 2、5、10、15、20 mL 對皂化速度的影響。乙醇加入量為2 mL時，溶液成粘稠狀，乙醇加入量在10 mL以上時，乙醇對氫氧化鉀起到稀釋作用，皂化速度減慢，且乙醇含量過高，膽固醇的回收率降低，所以選擇乙醇的加入量為5 mL。

在100℃水浴中，油樣中分別加入5 mL乙醇、2 mL 25%氫氧化鉀溶液，考察皂化時間為30、40、50、60、90、120 min時對提取廢棄適用油脂中膽固醇含量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著皂化時間的增加（30 min～60 min），廢棄食用油脂中膽固醇的含量逐漸增加，皂化時間大于60 min后，廢棄食用油脂中膽固醇的含量沒有明顯變化，所以選擇皂化時間為60 min為反應(yīng)條件。

2.2 提取條件的選擇

為使油樣皂化完全，皂化反應(yīng)中加入過量的氫氧化鉀溶液，所以皂化液中有氫氧化鉀剩余。加入無水硫酸鈉（500℃烘烤4 h）吸收皂化液中剩余的水，再用乙醇提取，提取液顯強堿性，直接進樣分析會損壞色譜系統(tǒng)，若用10%的硫酸溶液調(diào)節(jié)皂化液至中性，無水硫酸鈉吸收水后，再用乙醇提取，脂肪酸鹽也被提取出來，濃縮，定容后部分油樣成明膠狀，無法進樣分析。

分別用20 mL正己烷和混合溶劑（乙醚與石油醚比例為1∶1，體積比）代替乙醇作為提取溶劑提取皂化液中膽固醇，重復(fù)提取2次，合并上層萃取液，濃縮，用乙醇定容到5 mL，過0.45 μm的有機濾膜，上機測定。由于正己烷極性較小，膽固醇提取率較低，而混合溶劑（乙醚與石油醚比例為1∶1，體積比）中膽固醇的回收率較高。為了減少脂肪酸鹽進入提取液中，將提取液濃縮近干，用丙酮轉(zhuǎn)換混合溶劑，析出大量的脂肪酸鹽沉淀，取上清液濃縮近干，用乙醇定容、過膜測定，膽固醇的回收率低（約45%）且在提取過程中易乳化。

本試驗選擇在皂化液中加入適量的水和氯化鈉，再用混合溶劑（乙醚與石油醚比例為1∶1，體積比）提取膽固醇，既可減少脂肪酸鹽進入有機相，又能防止乳化，但隨著水加入量的增加，膽固醇的回收率逐漸降低，所以選擇在皂化液中加入3 mL水。

2.3 標準曲線與檢出限

分別吸取 0.30、0.60、1.20、2.00、3.00、4.50 mL 標準儲備液于25 mL容量瓶中，用乙醇定容到25 mL，即為0.012、0.024、0.048、0.08、0.12、0.18 mg/mL 的標準使用液。0.5 mg/mL的標準使用液是將標準儲備液稀釋2倍得到的。以膽固醇的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標進行回歸分析，線性范圍為0.012 mg/mL～0.5 mg/mL，線性回歸方程為y=0.000 001x+45 548，相關(guān)系數(shù)為0.999 7。以3倍的信噪比計算方法的檢出限為0.005 mg/g。

表1 方法的精密度（n=6）Table 1 Precision of the method

2.4 方法的精密度與回收率

在空白樣品中添加低、高2種不同濃度的膽固醇標準溶液，制成供試樣品，按試驗方法處理，重復(fù)測定濃縮液8次，相對標準偏差結(jié)果見表1。

于廢棄食用油脂中，在方法的線性范圍內(nèi)分別加入低、高濃度膽固醇標準溶液，用標準加入法測定其回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收試驗結(jié)果Table 2 Results of test for recovery

2.5 樣品分析

取植物油和廢棄食用油脂樣品，按1.3節(jié)的方法處理，分別精密吸取標準品溶液和樣品濃縮液各20 μL，注入液相色譜儀，按1.4色譜條件測定峰面積值，外標單點法計算膽固醇含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品分析結(jié)果Table 3 Analytical results of samples

續(xù)表3 樣品分析結(jié)果Continue table 3 Analytical results of samples

3 結(jié)論

所建方法具有準確、重現(xiàn)性好、操作簡單等特點，適用于廢棄食用油脂中膽固醇含量測定，為鑒別摻有廢棄食用油脂的植物油提供技術(shù)支持。

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