沈暉，趙叢叢，劉曾，曾凡駿

（四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都 610065）

薯蕷皂甙元又稱皂素，可溶于石油醚等有機(jī)溶劑，自上世紀(jì)30年代日本生化學(xué)家從薯蕷屬的山箄中分離出第一個(gè)薯蕷皂甙元，開創(chuàng)了利用植物原料進(jìn)行甾體藥物合成的先河以來[1]，已有約400多種藥物以薯蕷皂甙元為原料或中間產(chǎn)物，通過衍生、合成而制得。我國(guó)作為薯蕷皂甙元主要生產(chǎn)國(guó)，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的60%，其中2/3直接用于出口[2]。目前薯蕷皂甙元的檢測(cè)方法有氣相色譜、高效液相色譜法等，而一般薯蕷皂甙元生產(chǎn)企業(yè)條件設(shè)備有限，因此一種簡(jiǎn)單、有效、快速的薯蕷皂甙元含量的測(cè)定方法在實(shí)踐應(yīng)用中具有重要價(jià)值。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

752紫外光柵分光光度儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TG628A分析天平；DSY-1-4孔電熱恒溫水浴鍋：北京愛琦霞商貿(mào)有限公司；燒杯、比色管、移液管、比色皿、洗瓶、膠頭滴管若干等。

1.2 試劑

薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)品：成都普思生物科技有限公司；乙醇、高氯酸、冰乙酸均為分析純；蒸餾水。

5%香草醛-冰醋酸溶液：稱取5 g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100 mL。

薯蕷皂甙元標(biāo)準(zhǔn)溶液：20 mg薯蕷皂甙元標(biāo)準(zhǔn)品溶于石油醚中，定容于50 mL容量瓶中。

薯蕷皂甙元樣品溶液：準(zhǔn)確稱取菊葉薯蕷干粉20 g，加入80 mL濃度為3 mol/L的硫酸溶液酸解4 h，之后過濾，用水洗至中性，濾渣烘干，用400 mL石油醚抽提8 h，回收溶劑，待燒瓶中提取液體積50 mL左右停止加熱，提取液冷卻后倒入150 mL容量瓶中，石油醚定容，移液管移取10 mL至100 mL容量瓶中，用石油醚定容至100 mL。

2 檢測(cè)方法

2.1 檢測(cè)條件的確定

2.1.1 吸收光譜的確定

取皂甙元標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，樣品溶液0.1 mL于10 mL比色管中，揮干，再分別加5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL混勻、密塞，置70℃恒溫水浴中顯色15 min，取出后立即以冰水冷卻5 min，加入冰醋酸定容至10 mL，搖勻，靜置20 min，以試劑空白為參比，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)400 nm～700 nm處掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。

2.1.2 5%香草醛－冰醋酸溶液的加量

取標(biāo)準(zhǔn)皂甙元溶液0.1 mL于10 mL比色管中，揮干溶劑，分別加5%香草醛－冰醋酸溶液0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL和高氯酸0.8 mL混勻、密塞，置70℃恒溫水浴中顯色15 min，取出后立即以冰水冷卻5 min，加入冰醋酸定容至10 mL，搖勻，靜置20 min，以試劑空白為參比，用紫外分光光度計(jì)于薯蕷皂甙元最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.1.3 高氯酸溶液的加量

分別加高氯酸 0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL 和 0.2 mL 5%香草醛－冰醋酸溶液混勻，按2.1.2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 水浴溫度

按 2.1.2 實(shí)驗(yàn)，分別置于 50、60、70、80、90 ℃恒溫水浴中顯色15 min。

2.1.5 水浴時(shí)間

按2.1.2實(shí)驗(yàn)，分別置于80℃恒溫水浴中顯色5、10、15、20 、25 min。

2.1.6 放置時(shí)間

按2.1.2實(shí)驗(yàn)，搖勻后分別靜置 10、20、30、40、60min。

2.2 檢測(cè)方法評(píng)價(jià)

2.2.1 薯蕷皂甙元標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞比色管中，以上述實(shí)驗(yàn)所得的最優(yōu)檢測(cè)條件按2.1.2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，繪制薯蕷皂甙元標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取1 mL薯蕷皂甙元樣品溶液以實(shí)驗(yàn)確定的最佳檢測(cè)條件按2.1.2中操作進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定吸光度，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2.2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取已知濃度的薯蕷皂甙元樣品溶液5份（每份體積皆為0.1mL，同時(shí)取0.1mL樣液經(jīng)測(cè)定當(dāng)中薯蕷皂甙元濃度為0.206 mg/mL），分別加入非等量的薯蕷皂甙元標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL），以實(shí)驗(yàn)確定的最佳檢測(cè)條件按2.1.2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作并計(jì)算加標(biāo)回收率。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測(cè)條件的確定

3.1.1 吸收光譜的確定

薯蕷皂素檢測(cè)波長(zhǎng)掃描圖，見圖1。

圖1 薯蕷皂素檢測(cè)波長(zhǎng)掃描圖Fig.1 Wavelength scan of diosgenin

由圖1可知薯蕷皂甙元的最大吸光度在452 nm處，因此選擇452 nm作為薯蕷皂甙元的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.1.2 5%香草醛－冰醋酸溶液加量對(duì)吸光度的影響

5%香草醛－冰醋酸溶液加量對(duì)吸光度的影響，見圖2。

圖2 5%香草醛-冰醋酸溶液加量對(duì)吸光度的影響Fig.2 Effect of 5%vanillin-glacial acetic acid solution dosage on absorbance

由圖2可以看出，隨著香草醛－冰醋酸加量的增大，吸光度增大，當(dāng)其加量到0.2 mL后，吸光度趨于穩(wěn)定，確定5%香草醛－冰醋酸的加量為0.2 mL。

3.1.3 高氯酸溶液加量對(duì)吸光度的影響

高氯酸溶液加量對(duì)吸光度的影響見圖3。

圖3 高氯酸加量對(duì)吸光度的影響Fig.3 Effect of high acid solution dosage temperature

圖3表明隨著高氯酸溶液的加量的增加吸光度先增大后減小，當(dāng)用量在0.7 mL時(shí)，吸光度達(dá)到最大，因此確定高氯酸的加量為0.7 mL。

3.1.4 水浴溫度對(duì)吸光度的影響

水浴溫度對(duì)吸光度的影響見圖4。

圖4 水浴溫度對(duì)吸光度的影響Fig.4 Effect of water bath temperature

由圖4知水浴溫度在70℃以下時(shí)，吸光度較為穩(wěn)定，溫度在80℃時(shí)，吸光度達(dá)到最大，之后隨著溫度的增加吸光度急劇下降，故確定反應(yīng)溫度為80℃。

3.1.5 水浴時(shí)間對(duì)吸光度的影響

水浴時(shí)間對(duì)吸光度的影響見圖5。

圖5 水浴時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.5 Effect of water bath time on absorbance

由圖5可知一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)充分，吸光度也較為穩(wěn)定，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，副反應(yīng)的發(fā)生會(huì)影響顯色效果，導(dǎo)致吸光度下降。所以確定反應(yīng)時(shí)間為15 min。

3.1.6 放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響

放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響，見圖6。

由圖6看出，當(dāng)放置時(shí)間大于20 min時(shí)，吸光度趨于穩(wěn)定。因此確定放置時(shí)間為20 min。

圖6 放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.6 Effect of storage time on absorbance

3.2 實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià)

3.2.1 薯蕷皂甙元標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

薯蕷皂甙元標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示，結(jié)果表明薯蕷皂甙元在0.04 mg～0.24 mg范圍內(nèi)，吸收度呈良好線性關(guān)系，其回歸方程為y=4.237 1x+0.007 1，r=0.999 2。

圖7 薯蕷皂甙元標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Concentration-absorbency curve of diosgenin

3.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision experiment

由表1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.123%，方法重現(xiàn)性好。

3.2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

加標(biāo)回收率結(jié)果如表2所示。

表2 薯蕷皂甙元加標(biāo)回收率的計(jì)算Table 2 Results of average recovery

由表2中的計(jì)算結(jié)果表明用此檢測(cè)方法檢測(cè)薯蕷皂甙元具有較高的加標(biāo)回收率。

4 結(jié)論

本文對(duì)薯蕷皂甙元的檢測(cè)條件進(jìn)行了系統(tǒng)分析，得到最佳優(yōu)化條件為，檢測(cè)波長(zhǎng)：452 nm，5%香草醛-冰醋酸溶液的加量：0.2 mL，高氯酸溶液的加量：0.7 mL，水浴溫度：80 ℃，水浴時(shí)間：15 min，放置時(shí)間：20 min，精密度實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）與加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的平均回收率分別為1.123%與99.5%，通過以上分析表明該法具有良好的穩(wěn)定性、靈敏性與再現(xiàn)性，同時(shí)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定薯蕷皂甙元含量操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低，能夠滿足一般生產(chǎn)企業(yè)的需求。

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[1]陳新榮,楊天龍,胡世波.菊葉薯蕷產(chǎn)業(yè)化發(fā)展優(yōu)勢(shì)及綜合利用前景分析[J].攀枝花科技與信息,2007,11(4):6-8

[2]李輝,倪晉仁.薯蕷皂甙元的研究進(jìn)展[J].精細(xì)化工,2010,27(1):60-65

[3]王俊,楊克迪,陳鈞.分光光度法測(cè)定薯蕷皂苷元[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2004,23(1):73-75

[4]Slack S C,MaderW J.Colorimetric assay for diosgenin and related compounds[J].Analytical chemistry,1961,33(4):625

[5]喬春峰,檀愛民,董輝,等.國(guó)產(chǎn)閉鞘姜屬植物中薯蕷皂甙元的含量測(cè)定[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,31(2):156-158