王媛媛 曹 建 陳 勤 歐陽先國

1.南昌市第三醫(yī)院心內(nèi)科，江西南昌 330009；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西南昌 330006

促紅細(xì)胞生成素對小鼠心肌缺血損傷的心臟保護(hù)作用及機(jī)制

王媛媛1曹 建2陳 勤1歐陽先國1

1.南昌市第三醫(yī)院心內(nèi)科，江西南昌 330009；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西南昌 330006

目的 探討類似促紅細(xì)胞生成素（EPO）對小鼠心肌缺血損傷的保護(hù)作用。 方法 采用結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型。治療組大鼠（n＝40）采用腹腔注射方法給予EPO（1 μg/kg），對照組大鼠（n＝40）在相同的時(shí)間點(diǎn)給予等量的生理鹽水。處理后24 h通過TCC染色測量心肌梗死面積，處理后3、24 h，通過Western-blot法檢測STAT3蛋白表達(dá)。處理8周后，通過超聲心動圖測量左心室舒張期末容積、左心室收縮期末容積、左心室射血分?jǐn)?shù)。 結(jié)果治療組小鼠心肌梗死面積為24.6%，對照組小鼠心肌梗死面積為48.6%（P<0.05）；EPO干預(yù)后，與對照組比較，治療組STAT3蛋白表達(dá)增高（P<0.05）；治療組左心室舒張期末容積、左心室收縮期末容積、左心室射血分?jǐn)?shù)分別為 592 μl、371 μl、36%，對照組上述指標(biāo)分別為 740 μl、526 μl、27%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論EPO在小鼠心肌缺血損傷中具有心臟保護(hù)作用。

促紅細(xì)胞生成素；心肌梗死；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3

近年來研究表明促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）具有多種非促造血方面的細(xì)胞保護(hù)作用，特別是在抑制心臟重構(gòu)方面的作用日益受到關(guān)注，但其作用機(jī)制目前尚不十分明確，可能與抑制心肌細(xì)胞肥大和凋亡、抗炎、抗氧化、抑制成纖維細(xì)胞增殖等有關(guān)[1-2]。也有報(bào)道顯示其細(xì)胞保護(hù)作用與抑制膠原合成及影響基質(zhì)金屬蛋白酶活性等方面有關(guān)[3-4]。本實(shí)驗(yàn)擬在探討EPO在心肌缺血損傷中的保護(hù)機(jī)制，為臨床應(yīng)用EPO防治缺血再灌注引起的心臟功能損傷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及材料

取雄性Sprague-Dawley小鼠120只，8周齡，由南昌大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心制備成急性心肌梗死（AMI）模型，全部小鼠分3組，分別為對照組（40只），重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）組（40 只），假手術(shù)組（40 只）。 對照組小鼠誘導(dǎo)心肌梗死模型后給予生理鹽水，rhEPO組小鼠誘導(dǎo)心肌梗死模型后輸注rhEPO，假手術(shù)組在前降支留置一松結(jié)，不結(jié)扎。重組人紅細(xì)胞生成素注射液（益比奧，批號：20120207V，沈陽三生制藥有限公司），兔抗STAT3、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG均購自美國Santa生物公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠AMI模型的制作 參照Olivetti等[5]的手術(shù)方式結(jié)扎冠狀動脈左前降支制作AMI模型。假手術(shù)組僅在前降支留置一松結(jié)，不結(jié)扎。所有動物均分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飲食。1.2.2 EPO的心肌保護(hù)作用檢測 在結(jié)扎后5 min接受腹腔注射 rhEPO（1 μg/kg）（n=10）[6]，存活小鼠在 24 h 后處死，通過TCC染色測量心肌梗死面積。取新鮮大鼠心臟，用PBS緩沖液沖洗，濾紙吸干，-20℃冰凍30 min后將其橫斷面切成 1～2 mm 切片，1%TTC37℃染色25 min，切片放4%甲醛中過夜以增強(qiáng)顏色對比，非心肌梗死區(qū)染色為紅色，梗死區(qū)不染色。掃描儀掃描心臟切片，使用image proplus6.0軟件測量相關(guān)區(qū)域面積，梗死面積（%）=左心室組織切片梗死區(qū)面積/左心室組織切片總面積×100%。

1.2.3 STAT3蛋白表達(dá) 選取2組小鼠誘導(dǎo)心肌梗死模型后（n=20），分別用 rhEPO（1 μg/kg）、生理鹽水進(jìn)行處理（方法同1.2.2），手術(shù)處理后的存活小鼠在心肌梗死后3、24 h處死。通過組織顏色改變鑒別心肌缺血組織和正常組織，進(jìn)行組織切片后放入液氮冷凍，采用Western blot方法測定轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）。取大鼠左心室梗死邊緣區(qū)心肌組織標(biāo)本液氮研碎，加入裂解液，勻漿離心后，取上清液用BCA法測定蛋白濃度，變性后-80℃冰箱保存。取各組樣品50 μg，進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳將總蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1.5 h后，加入一抗稀釋液稀釋的 STAT3（1∶500）單克隆抗體，4℃冰箱中孵育過夜，用 TBST洗滌15 min×3次，加入二抗（HRP標(biāo)記二抗，1∶5000稀釋），室溫下?lián)u床孵育 1.5 h，用 TBST洗滌15 min×3次。ECL發(fā)光液顯色，膠片掃描后用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，以β-actin（1∶1000稀釋）作為內(nèi)參照對比，比值結(jié)果表示其蛋白的相對含量。

1.2.4 大鼠心功能測定 冠狀動脈結(jié)扎后5 min內(nèi)腹腔注射rhEPO1 μg/kg（n=10），生理鹽水 1 ml/kg（n=10），超聲心動圖基礎(chǔ)參考值由假手術(shù)組測得，所有小鼠在外科處理后8周后進(jìn)行超聲心動圖檢查。將小鼠用異氟烷（2%in oxygen）行輕度全身麻醉后，用12 MHz探頭進(jìn)行超聲心動圖檢查。二維的心室圖可以從四個(gè)腔室和胸骨旁長軸和短軸定位獲得。左心室舒張期末容積（LVEDV）和收縮期末容積（LVESV）可以通過Modified Simpson Rule測量，左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%。 所有測量均由同一觀察者行雙盲法測量，所有測量結(jié)果均連續(xù)測3～5次后取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，各組間不同時(shí)間階段超聲心動圖數(shù)據(jù)比較采用方差分析，同一時(shí)間組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組心肌梗死范圍的比較

冠狀動脈結(jié)扎注射5 min后注射藥物，24 h后處死存活小鼠，rhEPO處理組心肌梗死范圍為24.6%，對照組心肌梗死范圍為48.6%，心肌梗死面積減少近50%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；提示EPO對大鼠心肌梗死具有保護(hù)作用。

2.2 EPO對STAT3蛋白表達(dá)的影響

Western-blot分析STAT3蛋白，冠狀動脈結(jié)扎3、24 h后心肌梗死區(qū)域STAT3蛋白表達(dá)在冠狀動脈結(jié)扎后3 h就開始增高，在24 h恢復(fù)為正常，rhEPO組STAT3蛋白表達(dá)明顯高于對照組（P ＜ 0.05）（表 1）。

表1 rhEPO對小鼠心梗后STAT3蛋白表達(dá)的影響（±s，n=10）

表1 rhEPO對小鼠心梗后STAT3蛋白表達(dá)的影響（±s，n=10）

與對照組比較，*P<0.05

?

2.3 rhEPO對小鼠左室容積及射血分?jǐn)?shù)的影響

對照組、藥物處理組、假手術(shù)組小鼠冠狀動脈結(jié)扎5 min內(nèi)注射藥物，8周后通過超聲心動圖測量LVEDV、LVESV、LVEF。對照組LVEDV、LVESV、LVEF與假手術(shù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），rhEPO組與假手術(shù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表 2）。

表2 rhEPO對小鼠左室容積及射血分?jǐn)?shù)影響（±s，n=10）

表2 rhEPO對小鼠左室容積及射血分?jǐn)?shù)影響（±s，n=10）

與假手術(shù)組比較，*P<0.01，**P<0.05

組別 LVEDV（μl） LVESV（μl） LVEF（%）假手術(shù)組對照組rhEPO組420±4.2 740±5.6*592±2.7**182±3.6 526±2.4*371±3.6**56±1.4 27±3.7*36±1.3**

3 討論

EPO是由成人腎臟分泌的分子量為34 kD的調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的生長因子，它通過抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制來促進(jìn)紅系祖細(xì)胞的增殖、分化和成熟，是一種重要的細(xì)胞保護(hù)因子，對缺血缺氧性損傷的大腦、腎臟、心臟等多種器官組織起保護(hù)作用。本研究證實(shí)了EPO具有心臟保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)中EPO處理組小鼠心肌梗死面積較對照組減少，提示EPO對大鼠心肌梗死具有保護(hù)作用。超聲心動圖檢測結(jié)果顯示，EPO組LVEDV、LVESV、LVEF與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在冠狀動脈永久結(jié)扎后的小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥⑸銭PO后LVEDV、LVESV均較對照組下降，LVEF較對照組提高，提示EPO可以延緩心室重構(gòu)，改善心功能。

EPO對心臟保護(hù)作用的機(jī)制是非常復(fù)雜的，EPO可以促進(jìn)血管再生和祖細(xì)胞增殖，對于減少細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)具有重要作用。rhEPO減少小鼠心肌梗死面積可能歸功于它的促血管生成作用，有研究表明[7]，在心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入rhEPO可以明顯加快新生血管的形成，其效果甚至可以和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）相媲美，同時(shí)有研究證實(shí)rhEPO能夠刺激神經(jīng)和內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化[8]，因此rhEPO動員未分化細(xì)胞進(jìn)入缺血心肌組織并刺激其分化，可能也是其縮小心肌梗死范圍的一個(gè)機(jī)制。

EPO可以激活心臟保護(hù)級聯(lián)信號通路，特別是P13K/Akt通路[9-10]。對EPO神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，EPO通過與EPO-R結(jié)合，激活JAK2-PI3K-Akt通路，以及絲裂素激活蛋白激酶（MAPK）/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）等路徑，增加保護(hù)性基因轉(zhuǎn)錄或保護(hù)性蛋白表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生抗凋亡作用

STAT3屬于STAT蛋白家族，具有抗凋亡作用，包括7個(gè)成員，均在心肌細(xì)胞中表達(dá)。STAT3作為細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與多種基因表達(dá)調(diào)控，并參與多種心臟生理、病理活動，如心肌細(xì)胞存活、線粒體能量代謝、AngⅡ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、心肌細(xì)胞與血管再生、細(xì)胞外基質(zhì)變化及炎癥反應(yīng)[13-14]。EPO在冠狀動脈結(jié)扎3、24 h后，Western blot結(jié)果分析顯示出EPO激活了抗凋亡途徑，STAT3蛋白表達(dá)增加。而EPO最大的抗凋亡途徑在3 h后激活，效應(yīng)在24 h內(nèi)消退。這與EPO血漿半衰期有關(guān)，EPO血漿半衰期只有2 min[13]，可以在很短時(shí)間內(nèi)激活抗凋亡途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用rhEPO后小鼠心肌梗死面積減少，心肌功能明顯改善，而且心肌STAT3表達(dá)比對照組明顯增加。推測rhEPO可能通過增加核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子STAT3蛋白的表達(dá)，阻斷其引起的應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑的信號傳導(dǎo)，而發(fā)揮心肌保護(hù)作用?？梢钥紤]進(jìn)一步積極開展藥物處理后的基礎(chǔ)及臨床研究，對于防治缺血心肌的再灌注損傷具有重要理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1]Wang W，Kagaya Y，Asaumi Y，et al.Protective effects of recombinant human erythropoietin against pressure overload-induced left ventricular remodeling and premature death in mice[J].Tohoku J Exp Med，2011，225（2）：131-143.

[2]Brines M，Cerami A.Erythropoietinmediated tissue protection：reducing collateral damage from the primary injury responses[J].Intern Med，2008，264（4）：405-432.

[3]Bogoyevitch MA.An update on the cardiac effects of erythropoietin cardioprotection by erythropoietin and the lessons learnt from studies in neutoprotection[J].Cardiovasc Res，2004，63（2）：208-216.

[4]Riksen NP，Hausenloy DJ，Yellon DM，et al.Erythropoietin：ready for prime-time cardioprotection[J].Trends Pharmacol Sci，2008，29（8）：258-267.

[5]Olivetti G，Capasso JM，Meggs LG，et al.Cellular basis of chronic ventricular remodeling after myocardial infarction in rats[J].Circ Res，1991， 68（9）： 856-859.

[6]Lippi G，F(xiàn)ranchini M，F(xiàn)avaloro EJ.Thrombotic complications of erythropoiesis stimulating agents[J].Semin Thromb Hemost，2010，36（5）：537-549.

[7]付振虹，董蔚，蓋魯粵，等.促紅細(xì)胞生成素聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子治療大鼠急性心肌梗死[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（1）：17-21.

[8]馬寶新.促紅細(xì)胞生成素衍生物研究進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2011，32（2）：288-391.

[9]Tramontano AF，Muniyappa R，Black AD，et al.Erythropoietin protects cardiacmyocytes from hypoxia-induced apoptosis through an aktdependent pathway[J].Biochem Biophys Res Commun，2003，308 （4）：990-994.

[10]Chen Z，Li T，Zhang B，et al.Morphine postconditioning protects against reperfusion injury in the isolated rat hearts[J].J Surg Res，2008，145（2）：287-294.

[11]馬驥，鄭鳴之.促紅細(xì)胞生成素抑制心梗大鼠心肌核轉(zhuǎn)錄因子CHOP表達(dá)的研究[J].中國藥學(xué)雜志，2011，46（1）：24-27.

[12]Joshi D，Tsui J，Yu R，et al.Potential of novel EPO derivatives in limb ischemia[J].Cardilol Res Pract，2012，2（22）：1155-1785.

[13]Burger D，Xenocostas A，F(xiàn)eng QP.Molecular basis of cardioprotection by erythropoietin[J].Curr Mol Pharmacol，2009，2（7）：56-69.

[14]秦曉毅，盧新政.STAT3與心肌重構(gòu)[J].國際心血管病雜志，2012，39（3）：22-24.

The cardioprotective effect of erythropoietin on heart ischemic myocardial damage in rat

WANG Yuan-yuan1CAO jian2CHEN qin1OUYANG Xian-guo1

1.Department of Cardiology,the Third Hospital of Nanchang City in Jiangxi Province,Nanchang 330006,China;2.The Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo investigate the protective effects of erythropoietin(EPO)on heart ischemic myocardial damage in the rat.MethodsRat models of acute myocardial infarction(AMI)which were built by ligating the left anterior descending coronary artery were divided into two groups,treatment group(n=40)

1 μg/kg EPO through introperitoneal injection,and control group(n=40)received the same volume of saline through the same procedures.After 24 hours of treatment,the myocardial infarction area was evaluated by TCC dyeing,after 3,24 hours of treatment,the expression of STAT3 was analyzed by Westen blot,we assessed the LV end-diastolic volume (LVEDV),LV end-systolic volume(LVESV),LV ejection fraction(LVEF)of the rat by echocardiography after 8 weeks.ResultsThe myocardial infarct size of the erythroietin group was 24.6%,that of the control group was 48.6%(P<0.05).After treated with erythroietin,compared with the control group,the expression of STAT3 was increased(P<0.05),the LVEDV,LVESV,LVEF of the erythroietin group was 592 μl,371μl,36%,these of the control group were 740 μl,526 μl,27%.There was significant difference between control group and erythroietin group(P<0.05).ConclusionEPO has a cadioprotective effect on heart ischemic damage.

Erythropoietin;Myocardial infarction;Signal transducer and activator of transcription(STAT3)

R-332

A

1674-4721（2013）08（c）-0020-03

2013-01-31 本文編輯：魏玉坡）