張利難 馮瑞錚 張寶林

山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科，山西太原 030001

應(yīng)用富含血小板血漿構(gòu)建組織工程骨的研究

張利難 馮瑞錚 張寶林

山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科，山西太原 030001

目的 探究富含血小板血漿（PRP）是否能成為接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）于3D支架中的有效媒介，是否具有促進(jìn)骨組織再生、新生骨成熟及血管化的作用，為組織工程骨的構(gòu)建策略及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法 體外培養(yǎng)新西蘭兔BMSCs至第三代作為種子細(xì)胞，分別應(yīng)用PRP組、乏血小板血漿（PPP組）重懸BMSCs，雙相接種法構(gòu)建細(xì)胞/支架復(fù)合體，另設(shè)對(duì)照組，通過(guò)檢測(cè)支架內(nèi)DNA含量、堿性磷酸酶（ALP）含量，對(duì)比細(xì)胞的接種效率、增殖和分化情況。結(jié)果PRP組的成骨量較PPP組和對(duì)照組顯著（P<0.05）。 結(jié)論 用PRP介導(dǎo)的雙相接種法可以促進(jìn)BMSCs在細(xì)胞/支架復(fù)合物中增殖并向成骨分化；PRP雙相接種法是一種可行的構(gòu)建組織工程骨的方法，具有很大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

組織工程骨；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；富含血小板血漿；3D-PLGA支架

骨組織工程的核心在于“仿生”，即構(gòu)建適合成骨的內(nèi)環(huán)境，模擬自然成骨機(jī)制，實(shí)現(xiàn)骨移植物與宿主組織的生物學(xué)相容，在成骨的同時(shí)組織工程支架材料逐步降解成無(wú)毒害代謝物，移植物復(fù)合體最終被新生骨組織替代。理想的組織工程骨應(yīng)具有強(qiáng)大的骨誘導(dǎo)和血管生成潛能、生物學(xué)安全、低并發(fā)癥、構(gòu)建程序簡(jiǎn)便、使用壽命長(zhǎng)等特征[1-2]。目前的移植物尚未完全達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。學(xué)者們?cè)跇?gòu)建組織工程骨的嘗試中，逐漸認(rèn)識(shí)到細(xì)胞和生物活性因子的復(fù)合構(gòu)建比單純細(xì)胞或生物活性因子的構(gòu)建成骨效果要好[3]。在成骨系細(xì)胞的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族（Bmp）、血小板源生長(zhǎng)因子 （PDGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）是已被證實(shí)的具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)成骨作用的細(xì)胞因子[4-7]。

富含血小板血漿（platelets-rich plasma，PRP）是將全血離心后得到的血小板濃縮物，濃度通常為全血的4～6倍，其被凝血酶激活后，可以釋放大量生長(zhǎng)因子，如PDGF、TGF、VEGF、表皮生成長(zhǎng)因子（EGF）、BMP 等[8]。 因此，以PRP為媒介復(fù)合種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨理論上有如下優(yōu)勢(shì)：PRP源自宿主自體血漿，生物相容性好，不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)；PRP在凝血酶激活下不僅可釋放大量生物活性因子，凝血反應(yīng)所引發(fā)的由液-固態(tài)轉(zhuǎn)變過(guò)程有利于細(xì)胞黏附在支架上，提高種子細(xì)胞的接種效率[9]；PRP所含成分和血漿相似，在一定程度上模擬了細(xì)胞增殖分化的微環(huán)境[10]；提取PRP和添加凝血酶的過(guò)程較簡(jiǎn)單，實(shí)際應(yīng)用上操作可行。

兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是理想的種子細(xì)胞。其有可以較容易地提取、具有強(qiáng)大的體外擴(kuò)增能力和分化潛能、免疫排斥反應(yīng)輕微等優(yōu)點(diǎn)[11]。為了探究PRP能否在組織工程骨支架材料上促進(jìn)種子細(xì)胞的黏附、增殖、分化，本研究以 MSCs為種子細(xì)胞設(shè)計(jì)了 2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，PRP組（MSCs+PRP+支架）和 PPP 組（MSCs+PPP+支架），另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組（MSCs+支架），比較MSCs的增殖和分化情況。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭白兔1只，2月齡，體重2.0～2.5 kg，雄性，來(lái)源于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物等級(jí)為清潔型。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM 培養(yǎng)基（LowGlucose，Gibco）、胎牛血清（Hyclone）、β-甘油磷酸鈉（10 mmol/L，Sigma）、L-抗壞血酸（50 μg/ml，Sigma）、地塞米松（10-8mol/L，Sigma）、胰蛋白酶（0.25%，Sigma）、L-谷氨酰胺（Sigma）、青霉素-鏈霉素（100 U/ml）、TGF-β1（10 μg/L，Sigma）、吲哚美辛（50 μmol/L，Sigma）、IBMX（0.5 mmol/L，Sigma）、牛胰島素（10 mg/L，來(lái)寶生物公司）、PBS 緩沖液。 淋巴細(xì)胞分離液（Percoll，Sigma）、0.25%胰酶（Sigma）、枸櫞酸葡萄糖抗凝劑ACD（0.48 g枸櫞酸、1.32 g枸櫞酸鈉、1.47 g葡萄糖）、3D-PLGA支架、凝血酶溶液（10 000 U 凝血酶，Sigma）、10%CaCl2（Sigma）、骨細(xì)胞消化液、小牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)液、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（南京建成生物工程研究所）、0.1%茜素紅-Tris-HCl染液、1%甲苯胺藍(lán)染液、油紅染液。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)，高速低溫離心機(jī)，孵箱，倒置相差顯微鏡，超聲細(xì)胞破碎機(jī)，熒光酶標(biāo)儀。

1.4 MSCs原代培養(yǎng)及傳代

于一只新西蘭白兔無(wú)菌環(huán)境下用骨穿針抽取5 ml脛骨骨髓于10 ml注射器中（肝素鈉溶液1000 U/ml預(yù)先潤(rùn)洗抗凝）。將抽取的骨髓液注入15 ml離心管中，1000 r/min，離心5 min。離心后可見(jiàn)液面上層淡黃色脂肪層。抽棄位于最上層的脂肪層，將骨髓液注入預(yù)熱的PBS緩沖液或DMEM培養(yǎng)基中，輕輕吹打混勻。新鮮配制的Percoll淋巴細(xì)胞分離液10 ml，將混勻后的液體按等體積緩緩加入Percoll中，避免沖破液面。2000 r/min離心，20 min。吸出中間淡黃色單核細(xì)胞層，移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入低糖DMEM 10 ml， 其中含有 10%FBS，100 U/ml青霉素-鏈霉素。 調(diào)整細(xì)胞接種密度 1.0×104/ml，孵箱設(shè)定 37℃，5%CO2，孵育1 d，半量換液，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，繼續(xù)孵育，第3天全量換液。繼續(xù)培養(yǎng)大約2周時(shí)，可見(jiàn)大量多角行及紡錘形細(xì)胞增殖，待細(xì)胞90%融合時(shí)，0.25%胰酶消化、收集細(xì)胞至 15 ml離心管中，200×g離心10 min，棄上清液，DMEM重懸細(xì)胞團(tuán)，以1.0×104/ml的密度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，加入15 ml培養(yǎng)基，37℃，5%CO2孵育，每3天換液一次。細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第三代凍存于-80℃液氮瓶中，備用于MSCs細(xì)胞驗(yàn)證和細(xì)胞/支架復(fù)合體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。

1.5 MSCs細(xì)胞的驗(yàn)證

1.5.1 成骨誘導(dǎo)分化及鑒定 37℃水浴快速?gòu)?fù)蘇第3代細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，接種密度為1.0×104/ml，待細(xì)胞80%～90%融合時(shí)加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（低糖全培養(yǎng)基中加入β-甘油磷酸鈉 10 mmol/L、L-抗壞血酸 50 μg/ml、地塞米松10-8mol/L）進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)至14 d后，PBS沖洗2次，95%乙醇固定10 min，雙蒸水沖洗3次。0.1%茜素紅-Tris-HCl（pH 8.3）37℃，30 min。 蒸餾水沖洗，干燥，封片。倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.5.2 成軟骨誘導(dǎo)分化及鑒定 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)方法同上，待細(xì)胞80%～90%融合時(shí)加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（低糖全培養(yǎng)基中加入 L-抗壞血酸50 μg/ml、地塞米松10-8mol/L、TGF-β110 μg/L），培養(yǎng)至 14 d 后，用 10%甲醛固定 1 h，自來(lái)水沖15 min，蒸餾水洗一次，1%甲苯胺藍(lán)染2～4 h。加入95%乙醇，洗去多余的染液，倒置顯微鏡下觀察。

1.5.3 成脂誘導(dǎo)分化及鑒定 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)方法同上，待細(xì)胞80%～90%融合時(shí)加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（低糖全培養(yǎng)基中加入 0.25 μmol/L 地塞米松，50 μmol/L 吲哚美辛，0.5 mmol/L IBMX，10 mg/L牛胰島素），誘導(dǎo)2周后，細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌，10%甲醛固定30 min，稀釋油紅儲(chǔ)存液，油紅∶去離子水＝3∶2，濾紙過(guò)濾，室溫放置10 min，染色10 min左右。脫色，復(fù)染，甘油明膠封片。倒置顯微鏡觀察。

1.6 細(xì)胞/支架復(fù)合體構(gòu)建

1.6.1 PRP和PPP的制備 配置抗凝劑ACD：0.48 g枸櫞酸，1.32 g枸櫞酸鈉，1.47 g葡萄糖溶于100 ml雙蒸水中，0.45 μm過(guò)濾消毒，冷藏備用。于一只新西蘭白兔心臟抽取全血 40 ml，其中加入 40 ml ACD，搖勻，移入 50 ml離心管，1000 r/min離心15 min。取上層血漿，棄紅細(xì)胞，二次離心，3000 r/min離心20 min。上層為清亮的PPP，移入另一個(gè)15 ml離心管中備用。中間層為白色的血小板，輕輕用吸管攪動(dòng)吸出移至另一離心管中，下層紅細(xì)胞棄之。用少量PPP將血小板重懸，人工血小板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)成濃度為106/μl的 PRP 備用。

1.6.2 支架的預(yù)處理 3D-PLGA支架規(guī)格為100 mm×30 mm×3 mm，PLA∶PGA=75∶25。 空隙率為 85%～90%， 孔徑大小100～300 μm。用11號(hào)尖刀片將大塊PLGA切成長(zhǎng)寬均為10 mm，厚3 mm的立方體。將3D-PLGA小塊浸泡于75%乙醇中24 h，PBS緩沖液反復(fù)漂洗3次，然后將其多余水分吸干，經(jīng)預(yù)濕處理后，再滴加細(xì)胞懸液，以增加支架的親水性。

1.6.3 構(gòu)建細(xì)胞/支架復(fù)合體 將上述支架分3組，分別為PRP、PPP、空白對(duì)照組，每組8個(gè)樣本。將第三代種子細(xì)胞MSCs低速離心后，PRP組采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基加PRP溶液重懸細(xì)胞，PPP組采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基加PPP溶液重懸細(xì)胞，空白對(duì)照組單純采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法調(diào)整細(xì)胞密度至5.0×107/ml，制成高密度細(xì)胞懸液。用微量移液槍吸取細(xì)胞懸液緩緩滴加于支架材料上，隨即滴加0.05 ml凝血酶溶液（10 000 U凝血酶加入10%CaCl2中），做到不使細(xì)胞溢出，移入六孔板中，每孔5 ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基，放置孵箱中，37℃，5%CO2，孵育 1 h后，再次滴加細(xì)胞懸液于支架上，形成二次沉淀，以提高接種數(shù)量。接種后48 h倒置顯微鏡下觀察。第3天半量換液，以后每隔2～3 d全量換液。

1.7 細(xì)胞/支架復(fù)合體DNA定量分析

培養(yǎng)至第15天時(shí)，PBS緩沖液漂洗細(xì)胞/支架復(fù)合體2次，放入15 ml離心管中，剪成小塊，加1 ml骨細(xì)胞消化液，37℃水浴2 h。將消化混合液吸入15 ml離心管，超聲細(xì)胞破碎機(jī)處理 5 次，6 s/次，共 30 s，離心 200 r，5 min，取上清液待用。上清液50 μl置于48孔黑色不透光酶標(biāo)板內(nèi)，每個(gè)樣本2個(gè)副孔，每孔加150 μl Hoechst33258測(cè)試液（1 mg/ml），放入熒光酶標(biāo)儀樣品槽，震蕩混勻30 s，選擇激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm，以小牛胸腺DNA作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度。

1.8 細(xì)胞/支架復(fù)合體ALP活性定量分析

取方法6中的上清液，用ALP試劑盒（中國(guó)南京建成生物工程研究所）定量測(cè)定ALP活性。空白管加入雙蒸水0.05 ml、緩沖液和基質(zhì)液各0.5 ml，標(biāo)準(zhǔn)管加入0.05 ml 0.1 mg/ml酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液、緩沖液和基質(zhì)液各0.5 ml，測(cè)定管加入0.05 ml血清、緩沖液和基質(zhì)液各0.5 ml。上述液體充分混合，置于37℃恒溫水浴15 min。然后每管各加入1.5 ml顯色劑，立即混勻，520 nm，0.5 cm或1 cm光徑比色，空白管調(diào)零，測(cè)各管吸光度。吸光度的OD值依據(jù)公式轉(zhuǎn)化為ALP活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得結(jié)果均為計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey HSD test，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 種子細(xì)胞的提取和體外擴(kuò)增

運(yùn)用密度梯度離心法成功提取兔BMSCs，經(jīng)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)使其在體外大量擴(kuò)增（圖1、2）。

2.2 BMSCs細(xì)胞類型及分化潛能的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證所提取的種子細(xì)胞是兔BMSCs，利用BMSCs具有多向分化潛能這一特征，在不同培養(yǎng)環(huán)境下促使其向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化，經(jīng)細(xì)胞染色可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)出目標(biāo)細(xì)胞所具有的特征（圖3～5）。

上述結(jié)果說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所提取的種子細(xì)胞確為兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)下仍具有多向分化潛能。

2.3 各組BMSCs/支架復(fù)合體DNA含量的比較

細(xì)胞在體外培養(yǎng)的增殖表現(xiàn)為DNA含量的增高，通過(guò)比較BMSCs/支架復(fù)合體中細(xì)胞DNA含量，可以反映出各組細(xì)胞數(shù)量的差異，進(jìn)而說(shuō)明細(xì)胞擴(kuò)增的差異。PRP組的增殖趨勢(shì)較PPP組和空白對(duì)照組顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PPP組和空白對(duì)照組的DNA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 1）。

表 1 DNA 含量的比較（ng/ml，±s）

表 1 DNA 含量的比較（ng/ml，±s）

應(yīng)用（one-way ANOVA）及 Tukey HSD test分析，F(xiàn)=32.202

組別 n DNA含量PRP組PPP組空白對(duì)照組888 321.2500±3.8143 292.5380±3.8564 273.7000±4.8986

2.4 各組BMSCs/支架復(fù)合體ALP活性的比較

成骨細(xì)胞的ALP含量與成骨細(xì)胞的數(shù)量呈正比；通過(guò)比較各組ALP值，間接反映出成骨細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而比較各組向成骨細(xì)胞分化的差異；PRP組的成骨分化較PPP組和空白對(duì)照組顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PPP組和空白對(duì)照組的成骨分化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表 2 ALP 含量的比較（U/g prot，±s）

表 2 ALP 含量的比較（U/g prot，±s）

應(yīng)用（one-way ANOVA）及 Tukey HSD test分析，F(xiàn)=50.379

組別 n ALP PRP組PPP組空白對(duì)照組888 8.831 30±0.209 60 6.797 50±0.100 42 6.671 30±0.183 01

3 討論

本實(shí)驗(yàn)為使得種子細(xì)胞MSCs具有較好的生物活性，選用2月齡家兔作為骨穿對(duì)象。發(fā)現(xiàn)兔齡越小，相對(duì)于較大兔齡的BMSCsS，其活性更好，細(xì)胞增殖速率較快，傳代周期短。而兔齡過(guò)小帶來(lái)的缺點(diǎn)是增加了骨穿的難度，骨穿針易滑脫甚至穿過(guò)對(duì)側(cè)骨皮質(zhì)。此外，兔齡過(guò)小則單次抽取的骨髓量不宜過(guò)多，容易出現(xiàn)骨髓液被大量外周血稀釋的情況，故通常在2個(gè)以上穿刺點(diǎn)抽取骨髓液，以避免上述情況的發(fā)生。

MSCs體外培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞的接種密度不宜過(guò)高，細(xì)胞接種密度越高，培養(yǎng)條件亦相應(yīng)增高，低密度接種有利于細(xì)胞順利貼壁和擴(kuò)增[12]。選擇接種密度為1.0×104cells/cm2作為細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶的接種密度；選擇5×107cells/ml作為接種于支架的細(xì)胞懸液濃度。研究表明，細(xì)胞接種密度對(duì)于MSCs接種于支架材料后的分化潛能有很大影響[13]。細(xì)胞接種密度過(guò)小，細(xì)胞黏附于內(nèi)部支架材料的數(shù)量少，不利于細(xì)胞擴(kuò)增；細(xì)胞密度過(guò)大可能會(huì)超出孔隙的運(yùn)輸能力，引起養(yǎng)分相對(duì)不足，代謝產(chǎn)物堆積。2×107～6×107cells/ml是一個(gè)相對(duì)合適的范圍。

有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量（而不是單獨(dú)的總數(shù)量的細(xì)胞/支架），與骨形成存在潛在的呈正相關(guān)[14]。因此，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量這一參數(shù)可以作為評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)組織工程骨骨質(zhì)生成能力的指標(biāo)之一。細(xì)胞/支架復(fù)合體經(jīng)體外培養(yǎng)15 d后，大多數(shù)MSCs經(jīng)歷了細(xì)胞增殖周期向成骨細(xì)胞分化[15]。通過(guò)分析支架細(xì)胞的DNA含量和ALP含量，探究PRP是否具有促進(jìn)MSCs增殖并向成骨細(xì)胞分化的作用。表1、2結(jié)果顯示，PRP組DNA含量和ALP含量較PPP組和空白對(duì)照組增高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0 one-way ANOVA方差分析，PRP組和PPP組、對(duì)照組分析結(jié)果均得出P<0.05，可以認(rèn)為PRP是否具有促進(jìn)MSCs增殖并向成骨細(xì)胞分化的作用。而分析PPP組和對(duì)照組DNA含量得出P<0.05，ALP值P>0.05?？梢哉J(rèn)為PPP有一定的促進(jìn)MSC細(xì)胞增殖的作用，也可能存在PPP中血小板未完全分離棄去，或者在細(xì)胞換液時(shí)操作不當(dāng)造成誤差。

目前，PRP在組織工程領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。有學(xué)者以PRP 復(fù)合Ⅰ型膠原珠（type Ⅰ collagen beads，CIB）、BMSCs構(gòu)建組織工程骨植入兔骨缺損模型，證實(shí)該復(fù)合移植物有效地促進(jìn)骨質(zhì)生成修復(fù)骨缺損[16]。PRP應(yīng)用于軟骨缺損修復(fù)動(dòng)物模型，被證實(shí)可有效地釋放內(nèi)源性生長(zhǎng)因子，其復(fù)合 BMSCs和脂肪干細(xì)胞（adipose derived stem cells，ADSC）的組織工程骨均有效修復(fù)兔骨缺損[17]。德國(guó)學(xué)者Kasten等[18]對(duì)比研究了PRP和VEGF在兔大段骨缺損動(dòng)物模型上成骨及血管化進(jìn)程，通過(guò)組織學(xué)測(cè)定和大體CT攝像結(jié)果分析，認(rèn)為PRP和VEGF均有血管化作用，并且PRP的成骨作用強(qiáng)于VEGF。分析原因可能是PRP釋放的生長(zhǎng)因子是一類協(xié)同刺激因子，較單一的生長(zhǎng)因子效果明顯。雷華等[19]用PRP介導(dǎo)的雙相接種法構(gòu)建組織工程骨成骨效果顯著，成功修復(fù)山羊顱骨缺損。在口腔頜面外科領(lǐng)域，有學(xué)者嘗試用PRP復(fù)合牙髓細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，以血凝塊組，牙髓細(xì)胞組，PRP組對(duì)照，PRP復(fù)合牙髓細(xì)胞有效地促進(jìn)了牙根周圍及牙髓組織的組織再生[20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以PRP為媒介雙向接種法構(gòu)建的組織工程骨促進(jìn)BMSCs在細(xì)胞/支架復(fù)合物中的增殖，并促進(jìn)向成骨細(xì)胞分化。PRP雙相接種法是一種可行的構(gòu)建組織工程骨的方法，具有很大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

[1]Finkemeier CG.Bone-grafting and bone-graft substitutes[J].Bone Joint Surg Am，2002，84-A（3）：454-464.

[2]Younger EM，Chapman MW.Morbidity at bone graft donor sites[J].Orthop Trauma，1989，3（3）：192-195.

[3]Perka C，Schultz O，Spitzer RS，et al.The influence of transforming growth factor beta1 on mesenchymal cell repair of full-thickness cartilage defects[J].Biomed Mater Res，2000，52（3）：543-552.

[4]Guo X，Park H，Young S，et al.Repair of osteochondral defects with biodegradable hydrogel compositesencapsulating marrow mesenchymal stem cells in a rabbit model[J].Acta Biomater，2010，6（1）：39-47.

[5]Guo X，Liao J，Park H，et al.Effects of TGF-beta3 and preculture period of osteogenic cells on thechondrogenic differentiation of rabbit marrow mesenchymal stem cells encapsulatedin a bilayered hydrogel composite[J].Acta Biomater，2010，6（8）：2920-2931.

[6]van Hout WM，Mink van der Molen AB，Breugem CC，et al.Reconstruction of the alveolar cleft：can growth factor-aided tissue engineering replace autologous bone grafting?A literature review and systematic review ofresults obtained with bone morphogenetic protein-2[J].Clin Oral Investig，2011，15（3）：297-303.

[7]Tamama K，Kawasaki H，Wells A.Epidermal growth factor （EGF）treatment on multipotential stromal cells （MSCs）.Possible enhancement of therapeutic potential of MSC[J].Biomed Biotechnol，2010，2010：795385.

[8]唐鳳勤，鄒德榮.PRP復(fù)合間充質(zhì)干細(xì)胞在頜骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用[J].口腔頜面外科雜志，2008，18（3）：210-213.

[9]Intini G，Andreana S，Intini FE，et al.Calcium sulfate and plateletrich plasma make a novel osteoinductive biomaterial for bone regeneration[J].Transl Med，2007，7（5）：13.

[10]張森林，毛天球.應(yīng)用富血小板血漿和骨髓基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞-膜片及其以為成骨的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（3）：147-150.

[11]Tonti GA，Mannello F.From bone marrow to therapeutic applications：different behaviour andgenetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologousand foetal bovine sera?[J].Dev Biol，2008，52（8）：1023-1032.

[12]Lapi S，Nocchi F，Lamanna R，et al.Different media and supplements modulate the clonogenic and expansion properties of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J].BMC Res Notes，2008，28（1）：53.

[13]Kavalkovich KW，Boynton RE，Murphy JM，et al.Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells within an alginatelayer culture system[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim，2002，38（8）：457-466.

[14]Braccini A，Wendt D，F(xiàn)arhadi J，et al.The osteogenicity of implanted engineered bone constructs is related to thedensity of clonogenic bone marrow stromal cells[J].Tissue Eng Regen Med，2007，1（1）：60-65.

[15]雷華，肖苒，曹蕊，等.富含血小板血漿雙相接種法構(gòu)建組織工程骨[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2011，20（3）：402-407.

[16]Lin BN，Whu SW，Chen CH，et al.Bone marrow mesenchymal stem cells，platelet-rich plasma andnanohydroxyapatite-type Ⅰcollagen beads were integral parts of biomimetic bonesubstitutes for bone regeneration[J].Tissue Eng Regen Med，2012，doi：10.1002/term.1472.

[17]Xie X，Wang Y，Zhao C，et al.Comparative evaluation of MSCs from bone marrow and adipose tissue seeded inPRP-derived scaffold for cartilage regeneration[J].Biomaterials，2012，33（29）：7008-7018.

[18]Kasten P，Beverungen M，Lorenz H，et al.Comparison of platelet-rich plasma and VEGF-transfected mesenchymal stem cells onvascularization and bone formation in a critical-size bone defect[J].Cells Tissues Organs，2012，196（6）：523-533.

[19]雷華，唐曉軍，彭喆，等.富含血小板血漿雙相接種法構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)山羊顱骨缺損[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2011，20（4）：581-585.

[20]Zhu W，Zhu X，Huang GT，et al.Regeneration of dental pulp tissue in immature teeth with apical periodontitis using platelet-rich plasma and dental pulp cells[J].Int Endod J，2013.[Epub ahead of print]

The experiment of constructing tissue engineering bone with platelet-rich plasma

ZHANG Li-nan FENG Rui-zheng ZHANG Bao-lin

Department of Plastic Surgery,the First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University,Shanxi Province,Taiyuan 030001,China

ObjectiveTo investigate whether platelet-rich plasma(PRP)could be the effective seeding media of MSCs in 3D scaffold,whether PRP could enhance the effect or progress of osteogenesis,maturation and vascularization of new bone tissue,it is expected to further provide reference for strategy of bone engineering construction,animal experiments and clinical application.MethodsTo culture bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)of New Zealand rabbit in vitro,to adopt the third generation as seeding cell,to construct tissue engineering bones respectively with PRP biphasic seeding and PPP biphasic seeding,so that the combination of cell/scaffold could be formed,and the control group was established.By means of testing DNA contents and ALP contents in the cell/scaffold combinations,the proliferation and differentiation comparison between PRP group and PPP group could be evaluated.ResultsThe osteogenesis effect in PRP group was more remarkable compared to PPP group and control group(P＜0.05).ConclusionThe tissue engineering bone constructed by the PRP biphasic seeding strategy can promote the proliferation and osteogenesis of BMSCs in vivo.The PRP biphasic seeding is a practical way to construct tissue engineering bone,which has great potential and broad application prospects.

Tissue engineering bone;Bone mesenchymal stem cell;Platelet-rich plasma;3D-PLGA scaffold

R62

A

1674-4721（2013）08（b）-0020-05

2013-04-12 本文編輯：林利利）