陳 琛 李曉娟 李晟磊 張國俊

1.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450001；2.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450008；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南鄭州 450052

RIPTO-1在肺腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

陳 琛1李曉娟2李晟磊1張國俊3▲

1.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450001；2.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450008；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南鄭州 450052

目的 檢測組蛋白去CRIPTO-1在肺腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。 方法 采用免疫組織化學(xué)法檢測60例肺腺癌及20例正常肺組織中CRIPTO-1蛋白表達(dá)的情況，并分析其表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系。 結(jié)果 CRIPTO-1蛋白在肺腺癌組織中的陽性表達(dá)率（65.0%）顯著高于正常肺組織（15.0%），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。其蛋白表達(dá)與肺腺癌組織的分化程度、臨床分期、組織學(xué)分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 CRIPTO-1的過表達(dá)可能與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并對判斷肺腺癌患者的生物學(xué)行為具有一定的意義。

肺腺癌；CRIPTO-1；免疫組織化學(xué)；表達(dá)

人的CRIPTO-1基因最初在人畸胎癌cDNA的文庫中鑒定出來，因此也被稱為畸胎癌來源的生長因子-1（teratocarcinoma-derived growth factor 1，TDGF-1），其基因定位于染色體 3p21.3，是表皮生長因子（epidermalgrowthfactor，EGF）-cripto-1－FRL-1-cryptic（CFC）蛋白家族的成員[1]。 CRIPTO-1 mRNA和蛋白已經(jīng)被證實(shí)在多種不同類型的腫瘤中高表達(dá)，包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌及宮頸癌等[1-4]，提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測CRIPTO-1在正常肺組織及肺腺癌組織中的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與肺腺癌的分化程度、組織學(xué)分型、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院2010年1月～2013年3月肺腺癌切除標(biāo)本60例，其中，男36例，女24例；年齡34～81 歲，平均（55.22±16.2）歲；其中，高-中分化 39 例，低分化21例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期27例；組織學(xué)分型：微乳頭型5例，實(shí)體型11例，乳頭型26例，腺泡型18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例。另選取20例遠(yuǎn)端（10 cm以外）正常肺組織作對照。全部標(biāo)本均用體積分?jǐn)?shù)40 g/L多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4～6 μm，分別用于免疫組織化學(xué)及常規(guī)HE染色。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療、免疫治療及其他治療。

1.2 主要試劑

兔抗人CRIPTO-1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司公司，免疫組織化學(xué)試劑盒、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（digital audio broadcasting，DAB）顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 CRIPTO-1免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)SP法，常規(guī)脫蠟，PBS清洗，抗原修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS清洗，滴加正常山羊血清封閉，加Ⅰ抗（即用型），4℃冰箱過夜，PBS清洗，加Ⅱ抗，PBS清洗，加Ⅲ抗，PBS清洗，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用Novus Biologicals公司提供的切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

CRIPTO-1蛋白陽性信號(hào)呈淺黃色至棕黃色顆粒，也位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野（每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè)），按陽性細(xì)胞所占百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。采用9分評分制：按照陽性細(xì)胞比例≤10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分；按染色強(qiáng)弱：陰性為0分；淡黃色染色為1分；中度黃色染色為2分，棕黃色染色為3分。然后按照“陽性細(xì)胞得分×染色強(qiáng)弱得分”計(jì)總分，總分＜3為陰性，總分≥3為陽性[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CRIPTO-1在肺腺癌及正常肺組織中的表達(dá)

CRIPTO-1蛋白陽性顯色為棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，癌細(xì)胞中多呈強(qiáng)陽性表達(dá)（圖1A），正常肺組織中多不表達(dá)或表達(dá)程度較弱（圖1B）。CRIPTO-1在肺腺癌及正常肺組織中的表達(dá)結(jié)果見表1。

表1 CRIPTO-1在肺腺癌及正常肺組織中的表達(dá)（n）

2.2 CRIPTO-1的表達(dá)及其與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系

肺腺癌組織中CRIPTO-1蛋白過表達(dá)與肺腺癌組織的分化程度、臨床分期、組織學(xué)分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.217、5.862、11.334及 8.308，P<0.05）（表 2）。

表2 CRIPTO-1 mRNA的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系（n）

3 討論

CRIPTO-1與它的配體Nodal在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，并被發(fā)現(xiàn)與鼠和人的胚胎干細(xì)胞未分化的狀態(tài)密切相關(guān)[6]。與其他胚胎基因一樣，CRIPTO-1在多種類型腫瘤的形成和進(jìn)展、刺激細(xì)胞的增殖、遷移以及腫瘤的血管生成中起重要作用。一些研究表明胚胎發(fā)育期間的細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控和腫瘤發(fā)生期間的細(xì)胞轉(zhuǎn)化具有共同的信號(hào)調(diào)控途徑，提示胚胎信號(hào)途徑的未控制的激活可能在成人組織中驅(qū)動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤的進(jìn)展[7-9]。此外，CRIPTO-1在許多腫瘤中表達(dá)增加，其過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10-12]。

CRIPTO-1在小鼠EpH4乳腺上皮細(xì)胞中的過表達(dá)不僅促使細(xì)胞增殖加速和軟瓊脂錨錠非依賴性的生長，而且引起管樣結(jié)構(gòu)的形成，這一變化是在上皮細(xì)胞生長在Ⅰ型膠原基質(zhì)的條件下引起的[13]。第一次研究CRIPTO-1在EpH4細(xì)胞中的效果表明CRIPTO-1可能在誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞過渡中發(fā)揮重要作用。與此類似，過表達(dá)CRIPTO-1的人MCF-7乳腺癌細(xì)胞除了在無血清的培養(yǎng)基中獲得高增殖能力，而且能增加軟瓊脂中的克隆形成和增加失巢凋亡抗性，同時(shí)也表明采用的Boyden小室浸潤分析中浸潤能力的增強(qiáng)[3]，進(jìn)一步證實(shí)CRIPTO-1在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用的是在乳腺不典型增生和MMTVCripto-1轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤中的研究[14]。

本研究利用免疫組織化學(xué)方法研究肺腺癌組織中CRIPTO-1蛋白的表達(dá)，結(jié)果提示CRIPTO-1蛋白高表達(dá)于肺腺癌組織中，而正常肺組織中CRIPTO-1蛋白表達(dá)的陽性率非常低，提示從正常肺組織到肺腺癌組織的發(fā)生、發(fā)展及其演進(jìn)的過程中，CRIPTO-1可能起到了非常重要的作用。筆者進(jìn)一步分析了CRIPTO-1蛋白的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRIPTO-1蛋白表達(dá)與肺腺癌的分化程度、臨床分期、組織學(xué)分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，提示該基因可能在腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用，但具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

[1]Bianco C，Castro NP，Baraty C，et al.Regulation of human Cripto-1 expression by nuclear receptors and DNA promoter methylation in human embryonal and breast cancer cells[J].J Cell Physiol，2013，228（6）：1174-1188.

[2]Kuniyasu H，Yoshida K，Yokozaki H，et al.Expression of cripto，a novel gene of the epidermal growth factor family，in human gastrointestinal carcinomas[J].Jpn J Cancer Res，1991，82（9）：969-973.

[3]D′Antonio A，Losito S，Pignata S，et al.Transforming growth factor alpha，amphiregulin and cripto-1 are frequently expressed in advanced human ovarian carcinomas[J].Int J Oncol，2002，21（5）：941-948.

[4]Das AB，Loying P，Bose B.Human recombinant Cripto-1 increases doubling time and reduces proliferation of HeLa cells independent of pro-proliferation pathways[J].Cancer Lett，2012，318（2）：189-198.

[5]高冬玲，李晟磊，陳奎生，等.金屬蛋白酶抑制基因RECK在食管鱗癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義[J].世界華人消化雜志，2008，16（15）：1634-1638.

[6]Bianco C，Castro NP，Baraty C，et al.Regulation of human Cripto-1 expression by nuclear receptors and DNA promoter methylation in human embryonal and breast cancer cells[J].J Cell Physiol，2013，228（6）：1174-1188.

[7]Watanabe K，Nagaoka T，Lee JM，et al.Enhancement of Notch receptor maturation and signaling sensitivity by Cripto-1[J].J Cell Biol，2009，187（3）：343-353.

[8]Nagaoka T，Karasawa H，Turbyville T，et al.Cripto-1 enhances the canonical Wnt/β-catenin signaling pathway by binding to LRP5 and LRP6 co-receptors[J].Cell Signal，2013，25（1）：178-189.

[9]Nagaoka T，Karasawa H，Castro NP，et al.An evolving web of signaling networks regulated by Cripto-1[J].Growth Factors，2012，30（1）：13-21.

[10]De Luca A，Lamura L，Strizzi L，et al.Expression and functional role of CRIPTO-1 in cutaneous melanoma[J].Br J Cancer，2011，105（7）：1030-1038.

[11]Yoon HJ，Hong JS，Shin WJ，et al.The role of Cripto-1 in the tumorigenesis and progression of oral squamous cell carcinoma[J].Oral Oncol，2011，47（11）：1023-1031.

[12]Lawrence MG，Margaryan NV，Loessner D，et al.Reactivation of embryonic nodal signaling is associated with tumor progression and promotes the growth of prostate cancer cells[J].Prostate，2011，71（11）：1198-1209.

[13]De Angelis E，Grassi M，Gullick WJ，et al.Expression of cripto and amphiregulin in colon mucosa from high risk colon cancer families[J].Int J Oncol，1999，14（3）：437-440.

[14]Urba SG，Orringer MB，Turrisi A，et al.Randomized trial of preoperative chemoradiation versus surgery alone in patients with locoregional esophageal carcinoma[J].J Clin Oncol，2001，19（2）：305-313.

Expression and clinical significance of CRIPTO-1 in lung adenocarcinoma tissues

CHEN Chen1LI Xiao-juan2LI Sheng-lei1ZHANG Guo-jun3▲

1.Department of Pathology,the Medical college of Zhengzhou University;the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University;Henan key Laboratory of Tumor Pathology,Henan Province,Zhengzhou 450052,China;2.Basic Medicine College,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Henan Province,Zhengzhou 450008,China;3.Department of Respiratory,the First Affiliated Hospital,Zhengzhou University,Henan Province,Zhengzhou 450052,China

ObjectiveTo investigate expression and clinical significance of CRIPTO-1 in lung adenocarcinoma.MethodsImmunohistochemical staining were used to detect CRIPTO-1 protein expression in 60 cases of lung adenocarcinoma and 20 cases of normal lung tissue and the relationship between CRIPTO-1 expression and clinicopathological features of lung adenocarcinoma was analyzed.ResultsThe positive expression rate of CRIPTO-1 protein in lung adenocarcinoma (65.0%)was significantly higher than that in normal lung tissue (15.0%),and there was a significant difference in group comparison(P＜0.05).The expression of CRIPTO-1 protein was closely correlated with the differentiation,clinical stage,histological type and lymphatic metastasis in lung adenocarcinoma and there was a significant dif ference in group comparison (P＜0.05).ConclusionThe overexpression of CRIPTO-1 may be associated with the carcinogenesis and development of lung adenocarcinoma and can be used for juduing its biological behavior.

Lung adenocarcinoma;CRIPTO-1;Iimmunohistochemistry;Expression

R734.2

A

1674-4721（2013）08（b）-0017-03

河南省教育廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目（122300410363）▲

張國俊，主任醫(yī)師，教授，研究方向：肺癌的病因及發(fā)病機(jī)制

2013-06-07 本文編輯：林利利）