萬春平 熊尤龍 祁 燕 楊會軍 鄭 喜 王華寧

云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗室1(650021) 脾胃病科2

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，與克羅恩病(Crohn’s disease，CD)同屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)范疇，大量臨床和動物實(shí)驗研究表明細(xì)胞因子平衡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在IBD的發(fā)病和疾病進(jìn)程中起關(guān)鍵作用［1］。鑒于IBD系以腸黏膜免疫系統(tǒng)異常導(dǎo)致黏膜病理損傷為突出表現(xiàn)，目前關(guān)于細(xì)胞因子平衡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與UC的研究主要集中于腸黏膜免疫細(xì)胞方面，對腸黏膜周圍免疫器官——腸系膜淋巴結(jié)免疫功能狀態(tài)及其細(xì)胞因子調(diào)控在UC中的作用，尤其是Th17細(xì)胞作用的研究甚少。本研究應(yīng)用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型以模擬人類UC，探討腸系膜淋巴結(jié)Th1、Th17細(xì)胞在UC發(fā)病中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗動物和主要試劑、儀器

雌性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20～22 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實(shí)驗室，溫度(22±1)℃，濕度55%±5%，12 h明暗循環(huán)，飼料和飲用水消毒后由動物自由攝取。實(shí)驗開始前至少適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

DSS(上海西寶生物科技有限公司)，糞隱血測試盒(南京建成生物工程研究所)，BD OptEIATM小鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、小鼠干擾素-γ(IFN-γ)ELISA試劑盒、BD PharmingenTM小鼠CD16/CD32單克隆抗體(2.4G2)、PE-小鼠 CD11b 抗體(M1/70)、PE-CyTM5-小鼠 CD4 抗體(RM4-5)、PE-小鼠 IL-17A抗體(TC11-18H10)、FITC-小鼠 IFN-γ 抗體(XMG 1.2)、PE-小鼠 IgG1(A85-1)、BD FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)，小鼠CD3e純化單克隆抗體(145-2C11)、小鼠 CD28純化單克隆抗體(37.51)、小鼠IL-17A Platinum ELISA試劑盒、FITC-小鼠F4/80 抗體(BM8)(eBioscience，Inc.)。

二、方法

1.動物分組和結(jié)腸炎模型制備:20只小鼠隨機(jī)分為正常對照組和結(jié)腸炎模型組，每組10只，前者正常飲水，后者予含5%DSS的飲用水，每2 d更換一次飲用水，連續(xù)飲用7 d。

2.結(jié)腸炎癥程度評估:實(shí)驗過程中每天稱量小鼠體質(zhì)量，同時觀察糞便性狀和隱血情況，用于評估疾病活動指數(shù)(DAI)。無體質(zhì)量下降、下降1% ～5%、6% ～10%、11% ～15%、＞15%分別計 0、1、2、3、4分;糞便性狀正常、半稀便、稀便分別計 0、2、4分;糞隱血(－)、(+)、肉眼血便分別計 0、2、4分。DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3。于第8 d脫脊椎處死所有小鼠，取自肛門至盲腸段全結(jié)腸，測量其長度。

3.結(jié)腸組織IL-1β含量測定:取末端結(jié)腸組織并稱重，每10 mg組織加入冰冷 PBS(pH 7.2)50 μL，以剪刀剪碎組織后制備勻漿，4℃ 400×g離心15 min，吸取上清液，－20℃凍存。參照ELISA試劑盒說明書測定IL-1β含量。

4.腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞分離［2］以及IL-17A、IFN-γ的誘導(dǎo)表達(dá)和測定:無菌取小鼠腸系膜淋巴結(jié)，以玻片磨碎，200目尼龍篩網(wǎng)過濾，4℃ 300×g離心5 min，棄上清液，以含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/mL。將經(jīng)PBS稀釋的CD3單抗(5 μg/mL)加入96孔板，4℃包被過夜，PBS洗滌2次，加入上述分離得到的細(xì)胞(4 ×105/孔)和 CD28 單抗(1 μg/mL)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)36 h，收集培養(yǎng)上清液，參照ELISA試劑盒說明書測定IL-17A、IFN-γ含量。

5.流式細(xì)胞分析

①F4/80與CD11b雙標(biāo)記腸系膜淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞:收集2×106個腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞于FACS管中，F(xiàn)ACS洗液(含2%FBS的PBS)洗滌一次，以小鼠 CD16/CD32 單抗(2.4G2)阻斷 Fcγ 受體(FcγR)的非特異性結(jié)合后，加入 FITC-小鼠F4/80抗體、PE-小鼠CD11b抗體，冰上避光作用30 min，F(xiàn)ACS洗液洗滌一次，加入800 μL FACS洗液，上流式細(xì)胞儀檢測，BD CellQuest Pro軟件分析檢測結(jié)果。

②腸系膜淋巴結(jié)CD4+T細(xì)胞內(nèi)IL-17A、IFN-γ含量檢測:取4×106個腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞，與PMA(50 ng/mL)、ionomycin(750 ng/mL)、brefeldin A(10 μg/mL)混合，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，收集細(xì)胞，F(xiàn)ACS洗液洗滌2次，加入5 μL小鼠2.4G2單抗，4℃作用30 min以封閉FcγR，F(xiàn)ACS洗液洗滌一次，加入 PE-CyTM5-小鼠 CD4抗體，4℃作用30 min，F(xiàn)ACS洗液洗滌一次，固定液中固定，F(xiàn)ACS洗液洗滌一次，將細(xì)胞懸于穿膜液中，同時加入PE-小鼠IL-17A抗體、FITC-小鼠IFN-γ抗體，4℃作用30 min，上流式細(xì)胞儀檢測，BD CellQuest Pro軟件分析檢測結(jié)果。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況和結(jié)腸炎癥程度

造模過程中兩組均無小鼠死亡。結(jié)腸炎模型組小鼠實(shí)驗第2 d開始出現(xiàn)軟便，第5 d出現(xiàn)糊狀便、液態(tài)血便和明顯消瘦，此種情況一直持續(xù)至實(shí)驗結(jié)束，第6 d、第7 d體質(zhì)量與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1A);該組DAI亦隨實(shí)驗進(jìn)程而逐漸增加，于第7 d達(dá)峰值(見圖1B)。第8 d時(處死后)，正常對照組小鼠結(jié)腸外觀平滑，長度較長，無節(jié)段性壞死和膿性黏液，結(jié)腸炎模型組小鼠結(jié)腸紅腫、縮短并有節(jié)段性壞死，黏膜糜爛且有多量黏液(見圖1C)，結(jié)腸炎模型組結(jié)腸長度顯著短于正常對照組(見圖1D)。上述結(jié)果表明DSS小鼠急性結(jié)腸炎模型誘導(dǎo)成功。

二、結(jié)腸組織IL-1β蛋白表達(dá)和腸系膜淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞浸潤程度

結(jié)腸炎模型組結(jié)腸組織IL-1β蛋白表達(dá)較正常對照組顯著上調(diào)(見圖2A);該組腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80+CD11b+雙陽性細(xì)胞比例顯著高于正常對照組(見圖2B)，表明模型小鼠腸系膜淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞浸潤增加。

三、腸系膜淋巴結(jié)Th1、Th17細(xì)胞因子表達(dá)

ELISA檢測結(jié)果顯示，結(jié)腸炎模型組腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞經(jīng)CD3/CD28單抗誘導(dǎo)活化，分泌的Th17細(xì)胞因子IL-17A水平顯著高于正常對照組(見圖3A)，Th1細(xì)胞因子IFN-γ分泌水平略高于正常對照組，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖3B);進(jìn)一步以流式細(xì)胞術(shù)檢測活化腸系膜淋巴結(jié)CD4+T細(xì)胞內(nèi)的IL-17A、IFN-γ含量，結(jié)果顯示結(jié)腸炎模型組兩者表達(dá)均較正常對照組顯著上調(diào)(見圖3C)。

圖1 正常對照組與結(jié)腸炎模型組小鼠一般情況和結(jié)腸炎癥程度比較

圖2 正常對照組與結(jié)腸炎模型組結(jié)腸組織IL-1β蛋白表達(dá)和腸系膜淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞浸潤程度比較

討 論

圖3 正常對照組與結(jié)腸炎模型組腸系膜淋巴結(jié)Th1、Th17細(xì)胞因子表達(dá)比較

UC和CD是IBD的兩種主要類型，在病理學(xué)上均表現(xiàn)為腸黏膜慢性非特異性炎癥。IBD屬于自身免疫性疾病，其具體發(fā)病機(jī)制雖尚未闡明，但已知其發(fā)病與遺傳、免疫、環(huán)境因素以及腸黏膜屏障功能障礙密切相關(guān)，腸黏膜免疫系統(tǒng)異常是造成IBD時腸道炎癥和組織損傷的關(guān)鍵因素［3］。未致敏的CD4 T細(xì)胞經(jīng)抗原刺激活化后成為CD4+T細(xì)胞，后者在不同因素的作用下進(jìn)一步向 Th1、Th2、Th17、Treg等功能性細(xì)胞類型方向分化。Th1細(xì)胞主要分泌 IFN-γ、IL-2、IL-12，在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起重要作用;Th2細(xì)胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，其功能為促進(jìn)B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體，主要介導(dǎo)體液免疫反應(yīng);Th17細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一種由IL-23誘導(dǎo)分化、能分泌促炎細(xì)胞因子IL-17的新的Th細(xì)胞亞群，其主要作用是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［4］。

大量研究表明細(xì)胞因子平衡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在IBD的腸黏膜先天和獲得性免疫應(yīng)答調(diào)控中起重要作用?；顒悠贗BD患者炎癥黏膜和血清Th17細(xì)胞因子IL-17均呈高表達(dá)，并與腸黏膜免疫、炎癥反應(yīng)異常有關(guān)［5］，阻斷IL-17的作用能改善急性結(jié)腸炎模型小鼠的腸道炎癥和促炎細(xì)胞因子、趨化因子產(chǎn)生［6］，抑制巨噬細(xì)胞過度激活可通過抑制其NF-κB活化而抑制下游促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，改善結(jié)腸炎模型小鼠的腸道炎癥和組織學(xué)損傷［7］。然而，IBD不同發(fā)病階段以及不同類型IBD(UC或CD)的細(xì)胞因子平衡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在很大差異。研究［8］發(fā)現(xiàn)，在三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的CD樣結(jié)腸炎模型中，Th1-Th17型免疫應(yīng)答隨疾病的慢性化而逐漸增強(qiáng)(IL-12、IL-17表達(dá)上調(diào));而DSS誘導(dǎo)的UC樣結(jié)腸炎模型則表現(xiàn)為由Th1-Th17細(xì)胞介導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)(TNF-α、IL-17等表達(dá)上調(diào))向主要由Th2細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)(IL-4、IL-10表達(dá)上調(diào)，伴TNF-α、IL-17等表達(dá)下調(diào))轉(zhuǎn)化，根據(jù)細(xì)胞因子表達(dá)譜可鑒別IBD及其類型。然而另有研究報道，CD中可見Th2細(xì)胞因子(IL-5)高表達(dá)，UC中亦可存在Th1 細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ)高表達(dá)［8，9］，可見在不同類型IBD以及不同種類IBD動物模型中，腸道炎癥反應(yīng)以何種T細(xì)胞亞群占主導(dǎo)地位尚不能定論。

目前細(xì)胞因子平衡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在IBD中作用的研究主要集中于腸黏膜，關(guān)于腸系膜淋巴結(jié)免疫功能狀態(tài)及其細(xì)胞因子調(diào)控的研究開展甚少，本研究旨在闡明腸系膜淋巴結(jié)Th1、Th17細(xì)胞及其效應(yīng)細(xì)胞因子在DSS誘導(dǎo)的小鼠UC樣結(jié)腸炎發(fā)病中的作用。分離小鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞，并在體外以CD3/CD28單抗誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化，結(jié)果顯示結(jié)腸炎模型小鼠活化腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞分泌的Th17細(xì)胞因子IL-17A水平顯著高于正常對照組，Th1細(xì)胞因子IFN-γ分泌水平亦呈增高趨勢，且流式細(xì)胞分析證實(shí)模型小鼠活化腸系膜淋巴結(jié)CD4+T細(xì)胞內(nèi)IL-17A、IFN-γ表達(dá)顯著上調(diào)。上述結(jié)果表明UC樣結(jié)腸炎模型小鼠腸系膜淋巴結(jié)中的Th1、Th17細(xì)胞數(shù)量顯著增多。

大量研究表明，UC患者和UC樣結(jié)腸炎模型小鼠的腸黏膜中浸潤有大量巨噬細(xì)胞及其產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)，參與介導(dǎo)結(jié)腸黏膜病理損傷。IL-1β主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡等在內(nèi)的多種細(xì)胞生物學(xué)功能，并可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在IBD的腸黏膜病理損傷中發(fā)揮重要作用［10］。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸組織IL-1β蛋白表達(dá)較正常對照組顯著上調(diào)，提示模型小鼠腸黏膜巨噬細(xì)胞浸潤明顯，與既往研究結(jié)果相符。本實(shí)驗還觀察了結(jié)腸炎模型小鼠腸系膜淋巴結(jié)中的巨噬細(xì)胞浸潤程度。F4/80抗原是小鼠巨噬細(xì)胞最為常用的標(biāo)記物之一，另一個廣泛使用的巨噬細(xì)胞標(biāo)記物為 Mac-1(CD11b)，目前一般采用F4/80與Mac-1(CD11b)雙標(biāo)記巨噬細(xì)胞［11］，本研究亦采用此法標(biāo)記巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示結(jié)腸炎模型小鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞中的F4/80+CD11b+雙陽性細(xì)胞比例顯著高于正常對照組，提示在UC發(fā)病過程中，除腸黏膜巨噬細(xì)胞浸潤外，腸系膜淋巴結(jié)亦浸潤有大量巨噬細(xì)胞。

IL-17A是Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子，與受體結(jié)合后，通過激活NF-κB以及調(diào)節(jié)MAPK信號通路活性發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，具有強(qiáng)大的募集和激活中性粒細(xì)胞的能力，能誘導(dǎo)活化T細(xì)胞以及刺激成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，如IL-1β、IL-6、TNF-α、一氧化氮合酶-2(NOS-2)、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、金屬蛋白酶等而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［12，13］。而 IFN-γ 是 Th1 細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，在UC腸黏膜免疫應(yīng)答中起重要作用。基于本實(shí)驗和既往研究結(jié)果可以推測，在DSS誘導(dǎo)的小鼠UC樣結(jié)腸炎模型中，毗鄰腸黏膜的腸系膜淋巴結(jié)Th1、Th17細(xì)胞過度激活，釋放大量效應(yīng)細(xì)胞因子如IL-17A、IFN-γ，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤、活化，活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子如IL-1β，作用于臨近靶組織——結(jié)腸黏膜，參與介導(dǎo)黏膜炎癥反應(yīng)和病理損傷。T-bet、STAT4作為Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞方向分化，而轉(zhuǎn)錄因子RORγt則在Th17細(xì)胞的產(chǎn)生和分化過程中起重要調(diào)控作用。在DSS誘導(dǎo)的小鼠UC樣結(jié)腸炎模型中，T-bet、STAT4和 RORγt如何調(diào)控腸系膜淋巴結(jié)中的T細(xì)胞向Th1、Th17細(xì)胞方向分化，進(jìn)而介導(dǎo)腸黏膜病理損傷，有待進(jìn)一步研究。

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