蔡煒龍 許洪寶 汪偉民

浙江省湖州市中心醫(yī)院普外科(313000)

結(jié)腸癌是消化道常見(jiàn)惡性腫瘤之一。全球范圍內(nèi)，結(jié)腸癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第三位，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康［1］，其發(fā)病機(jī)制與年齡、環(huán)境、家族史、結(jié)腸疾病史、遺傳易感性等因素有關(guān)，是一個(gè)多階段、涉及多病程改變的逐漸積累的復(fù)雜過(guò)程。目前結(jié)腸癌的治療以外科手術(shù)為主，尚缺乏療效顯著的內(nèi)科藥物治療手段。本課題的前期研究［2］發(fā)現(xiàn)p28GANK在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁非癌組織，且與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期相關(guān)，提示p28GANK可能在結(jié)腸癌惡性進(jìn)展過(guò)程中起重要作用。RNA干擾(RNA interfering，RNAi)現(xiàn)象是一種序列特異性、轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過(guò)程。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)可有效誘導(dǎo)RNAi現(xiàn)象，從而抑制目的基因表達(dá)。本研究應(yīng)用慢病毒攜帶siRNA表達(dá)載體沉默p28GANK在結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29中的表達(dá)，探討p28GANK在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，以期為結(jié)腸癌的生物治療提供新靶點(diǎn)。

材料與方法

一、細(xì)胞株、主要試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29(美國(guó)ATCC公司)傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清以及1%青霉素-鏈霉素雙抗(HyClone公司)的 RPMI1640培養(yǎng)基中;針對(duì)p28GANK基因的慢病毒攜帶的siRNA載體(目的序列:5’-CTG ACC AGG ACA GCA GAA C-3’)、不含siRNA的對(duì)照病毒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建)［慢病毒均帶有綠色熒光蛋白(GFP)編碼基因］;兔抗人p28GANK多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);β-actin抗體(美國(guó)Sigma公司);辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗、細(xì)胞裂解液、ECL發(fā)光試劑盒、甲基噻唑基四唑(MTT)、甲紫、碘化丙啶(PI)染液(北京中山生物技術(shù)有限公司)。

二、方法

1.慢病毒轉(zhuǎn)染:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞以胰酶消化，5×103/孔接種于96孔板，于培養(yǎng)箱中(5%CO2、37℃)培養(yǎng)24 h，去除上清液，以無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次，每孔再加入0.6 mL無(wú)血清培養(yǎng)基，將針對(duì)p28GANK基因的siRNA慢病毒、對(duì)照病毒、RPMI1640培養(yǎng)基5 μL/孔加入孔中，輕搖至均勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后去除上清液，加入含1%青霉素-鏈霉素雙抗的10%胎牛血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，以胰酶消化細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)分選帶有綠色熒光細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×100)計(jì)數(shù)綠色熒光細(xì)胞，綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)≥95%表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功，將 siRNA慢病毒、對(duì)照病毒和RPMI1640培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株分別命名為Si-HT29、Con-HT29、HT29 細(xì)胞株。

2.蛋白質(zhì)印跡法:以細(xì)胞裂解液抽提 HT29、Con-HT29、Si-HT29 細(xì)胞總蛋白，取 200 μg蛋白質(zhì)于95℃加熱變性5 min，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，依次進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉，加入兔抗人p28GANK多克隆抗體(1∶100)、β-actin 抗體(1∶300)，4 ℃孵育過(guò)夜，室溫下復(fù)溫30 min后以PBS清洗3次，分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶2000)、羊抗鼠IgG二抗(1∶3000)孵育60 min，PBS再次清洗2次，加入ECL發(fā)光液顯色并定影，采用Bandscan 5.0軟件行條帶灰度分析，取p28GANK蛋白與內(nèi)參的灰度比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

3.MTT法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HT29、Con-HT29、Si-HT29細(xì)胞，以胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，以1×103/孔接種于96孔板，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d 后，每孔加入 5 mg/mL MTT 20 μL，常溫靜置4 h后去除上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，低速振蕩10 min。以酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度(A)值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

4.平板克隆實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29、Con-HT29、Si-HT29細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，以500/孔接種于6孔板，培養(yǎng)7 d后以PBS沖洗，4%甲醛固定10 min，甲紫染色10 min，以自來(lái)水沖洗。于光學(xué)顯微鏡下(×100)計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)量，每組細(xì)胞重復(fù)三次。

5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29、Con-HT29、Si-HT29細(xì)胞，以胰酶消化，然后1000 r/min(離心半徑10 cm)離心5 min后去除上清液，加入預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次離心(參數(shù)同前)，去除上清液，加入70%乙醇于4℃冰箱過(guò)夜，離心(參數(shù)同前)5 min，去除上清液，再次加入PBS清洗，加入PI染液于4℃冰箱避光孵育30 min，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。每組細(xì)胞重復(fù)三次。計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)，PI=(S+G2)/(S+G2+G0/G1)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、p28GANK蛋白表達(dá)水平

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，Si-HT29細(xì)胞中p28GANK蛋白表達(dá)水平顯著低于HT29、Con-HT29細(xì)胞(P＜0.05)，HT29、Con-HT29細(xì)胞間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見(jiàn)圖1)。

二、細(xì)胞增殖能力變化

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)第2 d時(shí)，HT29、Con-HT29、Si-HT29細(xì)胞增殖速度相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，培養(yǎng)第3～7 d時(shí)，Si-HT29細(xì)胞增殖速度較HT29、Con-HT29細(xì)胞顯著減緩(P＜0.05)，HT29、Con-HT29 細(xì)胞間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖1 HT29、Con-HT29、Si-HT29細(xì)胞的p28GANK蛋白表達(dá)情況(蛋白質(zhì)印跡法)

圖2 HT29、Con-HT29、Si-HT29細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖

三、細(xì)胞克隆形成能力

平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)7 d后，HT29、Con-HT29、Si-HT29細(xì)胞形成克隆的數(shù)量分別為110.31 ±12.52、109.92 ± 6.51、33.73 ± 9.75，Si-HT29細(xì)胞克隆數(shù)量較HT29、Con-HT29細(xì)胞顯著減少(P ＜0.05)，HT29、Con-HT29細(xì)胞間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(見(jiàn)圖3)。

四、細(xì)胞周期變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與HT29、Con-HT29細(xì)胞相比，Si-HT29細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例顯著增多，S期細(xì)胞比例顯著減少，PI值顯著降低(P＜0.05)(見(jiàn)圖4)。

圖3 HT29、Con-HT29、Si-HT29細(xì)胞平板克隆形成結(jié)果

討 論

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期以及PI值

結(jié)腸癌的演變過(guò)程涉及多因素、多分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，一部分分子在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用，針對(duì)這些關(guān)鍵分子采取生物靶向治療，是提高結(jié)腸癌治療效果的有效方法。p28GANK又名Gankyrin或PSMD10，定位于人類(lèi)染色體Xq22.3，最早從肝細(xì)胞癌組織中由消減雜交技術(shù)分離得來(lái)，具有6個(gè)重復(fù)的ankyrin結(jié)構(gòu)域蛋白，含226個(gè)氨基酸，在哺乳動(dòng)物中高度保守［3～5］。除腦和心臟外，p28GANK 在人體正常組織中多為陰性表達(dá)。研究［6～8］表明，p28GANK 在肝癌、食管癌、胰腺癌中表達(dá)上調(diào)，在腫瘤惡性進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，下調(diào)p28GANK表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展過(guò)程。本課題的前期研究［2］顯示，p28GANK表達(dá)與結(jié)腸癌惡性程度相關(guān)，其高表達(dá)提示患者預(yù)后不良。p28GANK可作為結(jié)腸癌診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)，是結(jié)腸癌潛在的治療靶點(diǎn)。

siRNA技術(shù)可使目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄后沉默，具有顯著下調(diào)目的基因表達(dá)的作用，是目前研究基因的重要方法［9］。慢病毒作為表達(dá)載體具有無(wú)毒、轉(zhuǎn)染效率高的特性［10］。本研究構(gòu)建了慢病毒攜帶siRNA作為下調(diào)p28GANK表達(dá)的工具，該載體包含GFP編碼基因，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在熒光顯微鏡下顯示綠色熒光，可有效判斷轉(zhuǎn)染效率，且本研究通過(guò)綠色熒光，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分選陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使陽(yáng)性轉(zhuǎn)染率達(dá)95%以上。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，siRNA慢病毒顯著抑制了p28GANK在結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29中的表達(dá)水平，提示Si-HT29細(xì)胞株構(gòu)建成功。以HT29細(xì)胞和Con-HT29細(xì)胞為對(duì)照，行MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Si-HT29細(xì)胞增殖速度顯著減緩;行平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Si-HT29細(xì)胞平板克隆形成能力顯著降低;進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化，結(jié)果顯示Si-HT29細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高，而S期細(xì)胞比例顯著降低，通過(guò)計(jì)算PI值證實(shí)Si-HT29細(xì)胞增殖能力顯著降低。上述研究結(jié)果與在食管癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞中下調(diào)p28GANK水平的效應(yīng)一致，提示p28GANK可作為惡性腫瘤生物治療的重要靶點(diǎn)。

多項(xiàng)研究［11，12］顯示，p28GANK 能夠通過(guò)激活周期素依賴性蛋白激酶4(CDK4)，促進(jìn)癌基因Rb編碼蛋白磷酸化失活。Higashitsuji等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，p28GANK可與癌基因MDM2結(jié)合，增強(qiáng)MDM2的生物活性，導(dǎo)致其對(duì)抑癌基因p53的降解能力增加。此外，Man等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中p28GANK可通過(guò)調(diào)節(jié)RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)Ras活化，后者在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起重要作用。CDK4激活、Rb磷酸化以及抑癌基因p53降解均可導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G1期，降低細(xì)胞增殖能力［11］。此與本研究結(jié)果一致，下調(diào)p28GANK表達(dá)導(dǎo)致結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖抑制、克隆形成能力降低，細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。Kim等［15］的研究發(fā)現(xiàn)，p28GANK在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與癌基因ErbB2呈正相關(guān)。下調(diào)p28GANK在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力。此外，在肝癌細(xì)胞中下調(diào)p28GANK的表達(dá)可抑制上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力［16］。Zhen等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，p28GANK可通過(guò)激活Rac1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［17］。上述研究結(jié)果提示p28GANK在腫瘤轉(zhuǎn)移中亦扮演重要角色。有關(guān)p28GANK在結(jié)腸惡性腫瘤增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

總之，本研究應(yīng)用慢病毒攜帶siRNA表達(dá)載體有效下調(diào)了p28GANK在結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29中的表達(dá)水平。下調(diào)p28GANK表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞周期阻滯，提示p28GANK可作為結(jié)腸癌生物治療的新靶點(diǎn)。

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