秦幼娟 周曉穎 趙 冰 劉 偉 潘曉林 張國新

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化科(210029)

幽門螺桿菌(Hp)是慢性胃炎、消化性潰瘍的重要致病因子，與胃癌、胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)，1994年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)將Hp定為Ⅰ類致癌原［1］。含克拉霉素的三聯(lián)或四聯(lián)療法是目前最常用的Hp根除方案，但隨著抗菌藥物的廣泛使用，Hp耐藥日趨嚴重，對克拉霉素耐藥是Hp根除失敗的主要原因之一。選擇快速、敏感、價廉的耐藥檢測方法對根除Hp具有重要意義。近年來分子生物學技術(shù)廣泛用于Hp耐藥基因的檢測，有研究［2］表明Hp對克拉霉素耐藥與Hp 23S rRNA V區(qū)點突變有關(guān)。本研究通過評價檢測糞便Hp基因突變對診斷克拉霉素耐藥的有效性，并探討cagA基因與耐藥的相關(guān)性，旨在探索一種快速、簡便的Hp耐藥檢測方法。

對象與方法

一、研究對象

選取2012年1～10月南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院經(jīng)13C-尿素呼氣試驗證實Hp感染的患者74例，其中男36例，女38例;年齡25～72歲，平均(49.4±5.6)歲;慢性胃炎50例、胃十二指腸球部潰瘍18例、胃癌6例。74例患者均來自南京地區(qū)。排除標準:①過去4周內(nèi)曾服用抗菌藥物、鉍劑、質(zhì)子泵抑制劑、H2受體拮抗劑;②胃、十二指腸球部潰瘍出血、穿孔;③妊娠或哺乳期婦女;④以往接受過Hp根除治療。采集患者新鮮糞便，2 h內(nèi)進行檢測或－80℃保存待測。本研究方案經(jīng)南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有入選者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.DNA提取:取適量糞便標本，采用糞便基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取DNA，具體操作步驟參照說明書進行。以Hp標準菌株悉尼菌株(上海市消化疾病研究所惠贈)作為陽性對照，以去離子水作為陰性對照。

2.巢式PCR法擴增:①第一輪擴增Hp 23S rRNA V區(qū)493 bp:Hp 23S rRNA 1835F:5’-GGT CTC AGC AAA GAG TCC CT-3’(1835 ～ 1854)，2327R:5’-CCC ACC AAG CAT TGT CCT-3’(2327 ～ 2310)。PCR 反應(yīng)體系 50 μL，包括25 mmol/L MgCl24 μL、10 × PCR 緩沖液5 μL、上下游引物各1 μL、dNTPs 1 μL、Taq 酶 3 μL、模板 DNA 2 μL 以及無菌去離子水33 μL。反應(yīng)條件:95℃預變性2 min;94℃變性30 s，57 ℃ 退火 37 s，72 ℃ 延伸 30 s，5 個循環(huán);94 ℃ 變性15 s，57 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸20 s，30 個循環(huán)。

②第二輪擴增Hp 23S rRNA V區(qū)367 bp:Hp 23S rRNA 1942F:5’-AGG ATG CGT CAG TCG CAA GAT-3’(1942 ～1962)，2308R:5’-CCT GTG GAT AAC ACA GGC CAG T-3’(2308～2287)。PCR反應(yīng)體系50 μL，包括第一輪擴增產(chǎn)物2 μL、25 mmol/L MgCl24 μL、10 × PCR 緩沖液 5 μL、上下游引物各1 μL、dNTPs 1 μL、Taq 酶 3 μL 等。反應(yīng)條件:95 ℃預變性2 min;94℃變性10 s，63℃退火20 s，72℃延伸20 s，25個循環(huán);72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。所有陰性標本加入β-actin引物擴增838 bp片段，反應(yīng)體系同上，反應(yīng)條件:95℃預變性1 min;95℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán);72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

3.PCR-RFLP檢測:取8 μL第二輪PCR產(chǎn)物分別加入限制性內(nèi)切酶BbsⅠ、BceAⅠ［紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司］，37℃孵育24 h;取8 μL第二輪PCR產(chǎn)物加入限制性內(nèi)切酶BsaⅠ［紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司］，50℃孵育24 h。酶切后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，若存在A2142G、A2142C、A2143G突變，突變位點即可分別被BbsⅠ、BceAⅠ、BsaⅠ酶切為兩個片段。

4.DNA測序:根據(jù)PCR-RFLP酶切結(jié)果，隨機選取2例野生型(未被酶切)和8例突變型(被酶切)標本的PCR產(chǎn)物，由華大基因有限公司純化后測序。

5.PCR 擴增 cagA 349 bp:cagA F:5’-GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAG G-3’，R:5’-CTG CAA AAG ATT GTT TGG CAG A-3’。PCR反應(yīng)體系同步驟①。反應(yīng)條件:95℃預變性5 min;94℃變性1 min，59℃退火1 min，72℃延伸1 min，40個循環(huán);72℃延伸7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。

三、統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，所得數(shù)據(jù)以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、Hp 23S rRNA PCR擴增結(jié)果

74例Hp陽性患者的糞便標本中，49例經(jīng)PCR擴增得到Hp 23S rRNA 493 bp片段，擴增率為66.2%，60例擴增得到Hp 23S rRNA 367 bp片段，擴增率為81.1%。陰性標本加入β-actin引物后均擴增出838 bp片段。

二、Hp 23S rRNA PCR-RFLP檢測結(jié)果

對60例Hp 23S rRNA擴增陽性產(chǎn)物進行酶切，結(jié)果顯示17例(28.3%)被 BsaⅠ酶切(見圖 1)，60例均未被BbsⅠ、BceAⅠ酶切。陽性對照均未被 BsaⅠ、BbsⅠ、BceAⅠ酶切。

三、cagA PCR擴增結(jié)果

60例Hp 23S rRNA擴增陽性標本中，46例cagA陽性表達，陽性率為76.7%，其中13例被 BsaⅠ酶切，突變率為28.3%;14例cagA陰性表達，其中4例被BsaⅠ酶切，突變率為28.6%，cagA陽性、陰性表達的突變率相比差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.01，P=0.98)。

圖1 BsaⅠ酶切Hp 23S rRNA產(chǎn)物圖

四、DNA測序

隨機選取的2例野生型和8例突變型標本的測序分析結(jié)果與基因組數(shù)據(jù)庫NCBI的Hp26695株(NC-000915)23S rRNA基因序列進行比較，結(jié)果顯示被酶切開的標本發(fā)生A2143G突變。

討 論

克拉霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類，是根除Hp的有效抗菌藥物之一，其抗菌機制為藥物進入細胞內(nèi)與核糖體緊密結(jié)合，作用于23S rRNA的多肽轉(zhuǎn)移環(huán)，抑制多肽轉(zhuǎn)移酶，阻止肽鏈延長，從而抑制蛋白質(zhì)合成?？死顾啬退巼乐赜绊慔p根除療效，而根除失敗亦可導致克拉霉素耐藥率增加。因此，臨床上亟需一種快速、準確診斷Hp對克拉霉素耐藥的方法。

Hp對克拉霉素耐藥與其23S rRNA V區(qū)點突變有關(guān)，在此基礎(chǔ)上開展快速、準確的Hp耐藥檢測可用于指導臨床治療，提高Hp根除療效。目前發(fā)現(xiàn)的Hp 23S rRNA突變類型包括 A2143G、A2142G、A2142C、A2142T、A2143C、G2115A、G2141A，其中A2143G突變最為常見且穩(wěn)定，占所有突變的45.1% ～82.1%，亦 存 在 A2143G+A2142G、A2143G+A2142C雙重突變［3］。Hp對克拉霉素耐藥的分子學檢測方法主要立足于檢測其23S rRNA點突變，基因測序是最準確的方法，但費時費力。目前應(yīng)用最多的是PCR-RFLP檢測，此方法檢測點突變較為敏感，且簡便易行，是檢測A-G突變的基本方法，最早于1996年Versalovic等［2］應(yīng)用此方法檢測到Hp 23S rRNA A2142G、A2143G 突變。Ménard等［4］的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BceAⅠ對PCR產(chǎn)物進行酶切，可檢測23S rRNA A2142C突變。

Hp對克拉霉素的敏感性檢測應(yīng)本著可靠、簡單、便于實施和推廣的原則。糞便取材方便且無痛苦、無創(chuàng)傷、經(jīng)濟成本低。Hp定居于胃黏膜上皮細胞表面，可隨胃黏膜上皮細胞更新脫落伴糞便排出。1994年Kelly等［5］從消化不良患者的糞便中分離出Hp。1995年Namavar等［6］應(yīng)用16S rDNA PCR和DNA雜交技術(shù)從糞便中檢測到Hp。1997年Kurokawa等［7］應(yīng)用細菌培養(yǎng)和PCR兩種方法檢測糞便中Hp，發(fā)現(xiàn)PCR敏感性較細菌培養(yǎng)高，但糞便中Hp含量較低，雜菌較多，尤其是糞便中的膽紅質(zhì)、膽鹽以及重金屬離子等可抑制Taq DNA聚合酶活性，去除上述干擾因素是實驗成功的關(guān)鍵。

本研究采用糞便基因組DNA快速提取試劑盒提取糞便DNA，PCR擴增率為81.1%，在研究中為避免假陰性，對所有陰性標本加入β-actin進行第二次擴增，均得到了838 bp的產(chǎn)物，說明此試劑盒能快速提取高質(zhì)量DNA，不存在抑制物造成的假陰性。同時，本研究采用巢式PCR法行兩次PCR擴增，克服了擴增平臺期效應(yīng)的限制，從而提高了PCR擴增敏感性，并由于模板和引物的改變，降低了非特異性反應(yīng)放大的可能性，保證了反應(yīng)的特異性。此外，本研究縮短了擴增時間，使檢測更迅速。

本研究對60例Hp 23S rRNA陽性擴增產(chǎn)物進行酶切，17例可被BsaⅠ酶切，但均未被BbsⅠ、BceAⅠ酶切，提示與克拉霉素耐藥有關(guān)的23S rRNA V區(qū)發(fā)生A2143G突變，不存在A2142G、A2142C突變。同時隨機抽取2例野生型和8例突變型標本檢測23S rRNA序列，結(jié)果證實對克拉霉素耐藥的標本均存在A2143G突變。綜合PCR-RFLP檢測結(jié)果和基因序列比對結(jié)果，提示江蘇地區(qū)Hp對克拉霉素的耐藥機制主要為23S rRNA A2143G突變。

cagA是Hp的重要毒力因子，可作為評價Hp毒力的指標。根據(jù)是否表達cagA可將Hp分為Ⅰ型菌株(表達cagA基因)、Ⅱ型菌株(不表達cagA基因)，Ⅰ型菌株產(chǎn)細胞毒素，為高毒力Hp菌株。本研究60例Hp 23S rRNA擴增陽性標本中46例cagA陽性表達，陽性率為76.7%，Hp感染以cagA基因陽性菌株為主，但cagA陽性、陰性表達者的突變率相比差異無統(tǒng)計學意義，提示cagA基因與Hp對克拉霉素耐藥不相關(guān)。

綜上所述，糞便取材方便、無痛苦、無創(chuàng)傷，用巢式PCR法提取糞便DNA，擴增Hp 23S rRNA，并檢測Hp感染以及23S rRNA點突變是判斷Hp對克拉霉素耐藥的有效方法，尤其適用于流行病學調(diào)查研究。未來有待進一步研究以建立Hp耐藥的流行病學資料，指導臨床合理用藥根除Hp。

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5 Kelly SM，Pitcher MC，F(xiàn)armery SM，et al.Isolation of Helicobacter pylori from feces of patients with dyspepsia in the United Kingdom［J］.Gastroenterology，1994，107(6):1671-1674.

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7 Kurokawa M，Minamide M，Nukina M，et al.Usefulness of Helicobacter pylori detection from feces specimens of the patients with peptic ulcer by polymerase chain reaction［J］.Kansenshogaku Zasshi，1997，71(11):1168-1171.