廉亞美 徐文娟 王海星 葉震世

廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科(361004)

核不均一核糖核蛋白A1(heterogeneous-nuclear ribonucleoprotein A1，hnRNPA1)為hnRNP A/B亞家族成員之一，是體內(nèi)重要的RNA結(jié)合蛋白，可在胞核與胞質(zhì)間自由穿梭，通過(guò)調(diào)節(jié)pre-mRNA和mRNA參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過(guò)程，并能維持某些基因的穩(wěn)定性，以及通過(guò)與不同基因結(jié)合激活不同信號(hào)通路，從而影響細(xì)胞生物學(xué)功能，在多種細(xì)胞分子、蛋白的成熟和生物學(xué)功能發(fā)揮以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用［1～5］。目前對(duì) hnRNPA1與胃癌的關(guān)系尚不十分清楚。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)靶向抑制人胃癌細(xì)胞株BGC-823中的hnRNPA1表達(dá)，旨在探討hnRNPA1在人胃癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，并明確其與胃癌的關(guān)系。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑、儀器

正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1和人胃癌細(xì)胞株MKN-28(高分化)、SGC-7901(中分化)、BGC-823(低分化)(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。兔抗人 hnRNPA1多克隆抗體(Abcam plc.)，兔抗人β-tubulin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(Cell Signaling Technology，Inc.)，pU6質(zhì)粒(廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保存)，Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑(Life Technologies Corporation)，CCK-8試劑盒(Dojindo Molecular Technologies，Inc.)，Transwell?細(xì)胞小室(Costar?，Corning)，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。Leica DM2500顯微鏡(Leica Microsystems)，BD Influx?流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng):所有細(xì)胞均為貼壁細(xì)胞，接種于無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。GES-1細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，MKN-28、SGC-7901、BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，兩種培養(yǎng)基使用前均添加青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL。0.02%EDTA/0.25%胰蛋白酶(1∶1)消化傳代。

2.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)hnRNPA1表達(dá):于細(xì)胞中加入500 μL裂解液，置冰上30 min后吸出裂解液，4℃ 13523×g離心20 min，吸取上清液，加入等體積蛋白上樣緩沖液(2×)，100℃變性5 min，-20℃保存?zhèn)溆?。制?2%SDS-PAGE凝膠，取蛋白樣品上樣并電泳，恒壓冰浴電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(1∶1000)，室溫孵育2 h或4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜10 min×3次，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL法顯色，攝片，觀察結(jié)果。

3.靶向hnRNPA1基因的siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建和干擾效果驗(yàn)證:以pU6質(zhì)粒(Amp抗性)為載體，將靶序列分別插入至相應(yīng)位置，形成4條寡核苷酸鏈(見表1)，構(gòu)建siRNA hnRNPA1重組質(zhì)粒。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按3×105/孔接種于6孔板，待細(xì)胞達(dá)到85% ～90%融合，按質(zhì)?！弥|(zhì)體為4 μg∶10 μL加入 Lipofectamine?2000 與質(zhì)粒復(fù)合物，4 h后更換為新鮮培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)設(shè)置重組質(zhì)粒(siRNA-1、siRNA-2)轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒pU6轉(zhuǎn)染組和空脂質(zhì)體對(duì)照組。以含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選，隨機(jī)挑選克隆傳代，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。收集細(xì)胞提取總蛋白，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)hnRNPA1蛋白表達(dá)。

表1 siRNA hnRNPA1正義鏈和反義鏈序列

4.CCK-8實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×103/mL、每孔 100 μL 接種于 96 孔板，分別于第 1、2、3、4、5、6 d，在每孔中加入 10 μL CCK-8 試劑，避光37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取各孔A值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、各復(fù)孔平均A值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞增殖抑制率=［(ApU6-A空白)-(AsiRNA-1hnRNPA1-A空白)］/(ApU6-A空白)×100%。

5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按3×105/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁達(dá)到90%，以10 μL移液器槍頭在每孔中間劃出直線劃痕，PBS洗滌3次以洗凈劃痕處脫落細(xì)胞，加入RPMI1640完全培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，棄去血清，PBS 洗滌2 ～3次，顯微鏡下觀察、拍照。以0 h時(shí)細(xì)胞劃痕為基線，測(cè)量72 h時(shí)細(xì)胞位移值，計(jì)算細(xì)胞遷移速率。

6.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn):細(xì)胞培養(yǎng)至良好狀態(tài)，常規(guī)胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞，鋪于包被有鼠尾膠原蛋白的Transwell小室內(nèi)，將小室放入含RPMI1640完全培養(yǎng)基的24孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16 h，取出小室，PBS沖洗，以棉棒擦去小室底部基質(zhì)膜上層細(xì)胞，預(yù)冷4%甲醇溶液固定10 min，0.2%結(jié)晶紫染色20 min，ddH2O沖洗，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)20倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

7.細(xì)胞凋亡檢測(cè):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按3×104/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁達(dá)到80% ～90%，以終濃度為300 mmol/L的 H2O2處理24 h，不含EDTA的胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105～1×106/mL，取1 mL細(xì)胞，4℃ 94×g離心10 min，棄上清液，1 mL冷PBS洗滌2次(4℃ 94×g離心10 min)，棄上清液，將細(xì)胞重懸于500 μL結(jié)合緩沖液中，加入10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min或4℃反應(yīng)30 min，于1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、hnRNPA1在正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株和人胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，GES-1細(xì)胞和MKN-28、SGC-7901、BGC-823 細(xì)胞中均有 hnRNPA1 蛋白表達(dá)，胃癌細(xì)胞株表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞株，BGC-823細(xì)胞表達(dá)水平最高(見圖1)，故選取BGC-823細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株和人胃癌細(xì)胞株hnRNPA1蛋白表達(dá)比較(蛋白質(zhì)印跡法)

二、siRNA hnRNPA1重組質(zhì)粒干擾效果驗(yàn)證

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，穩(wěn)轉(zhuǎn)siRNA-1 hnRNPA1、siRNA-2 hnRNPA1和pU6的BGC-823細(xì)胞中均有hnRNPA1蛋白表達(dá)，兩組siRNA hnRNPA1穩(wěn)轉(zhuǎn)組表達(dá)水平明顯低于pU6穩(wěn)轉(zhuǎn)組，表明siRNA hnRNPA1能有效抑制hnRNPA1表達(dá)，siRNA-1 hnRNPA1效果更為顯著(見圖2)，故選取siRNA-1 hnRNPA1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 siRNA hnRNPA1重組質(zhì)粒干擾效果驗(yàn)證(蛋白質(zhì)印跡法)

三、干擾hnRNPA1表達(dá)對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，siRNA-1 hnRNPA1穩(wěn)轉(zhuǎn)組BGC-823細(xì)胞第1～6 d 450 nm波長(zhǎng)處A值分別為0.24 ±0.02、0.21 ±0.01、0.30 ±0.02、0.39 ±0.03、0.59±0.03和0.67±0.02，pU6穩(wěn)轉(zhuǎn)組分別為0.25 ±0.03、0.33 ±0.01、0.44 ±0.02、0.62 ±0.04、0.85±0.04和 1.06±0.05(見圖 3)，siRNA-1 hnRNPA1穩(wěn)轉(zhuǎn)組第6 d細(xì)胞增殖抑制率為36.3%，表明干擾hnRNPA1表達(dá)能抑制BGC-823細(xì)胞的增殖能力。

圖3 兩株BGC-823細(xì)胞增殖能力比較(CCK-8實(shí)驗(yàn))

四、干擾hnRNPA1表達(dá)對(duì)BGC-823細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，siRNA-1 hnRNPA1穩(wěn)轉(zhuǎn)組BGC-823細(xì)胞24 h、48 h、72 h遷移細(xì)胞數(shù)均明顯少于pU6穩(wěn)轉(zhuǎn)組(見圖4)，兩組間遷移速率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［(5.44±0.25)μm/h對(duì)(9.37±0.49)μm/h，t=12.4，P ＜0.01］，表明干擾 hnRNPA1 表達(dá)能抑制BGC-823細(xì)胞的遷移能力。

五、干擾hnRNPA1表達(dá)對(duì)BGC-823細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，siRNA-1 hnRNPA1穩(wěn)轉(zhuǎn)組BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)16 h后穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)明顯少于pU6穩(wěn)轉(zhuǎn)組(見圖5)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(146.30±12.56對(duì)312.51±9.62，t=18.15，P＜0.01)，表明干擾 hnRNPA1表達(dá)能抑制 BGC-823細(xì)胞的侵襲能力。

圖4 兩株BGC-823細(xì)胞遷移能力比較(細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，×20)

六、干擾hnRNPA1表達(dá)對(duì)BGC-823細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞分析顯示，經(jīng)300 mmol/L H2O2處理24 h誘導(dǎo)凋亡后，siRNA-1 hnRNPA1穩(wěn)轉(zhuǎn)組BGC-823細(xì)胞凋亡率明顯低于pU6穩(wěn)轉(zhuǎn)組(見圖6)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.6%±0.3%對(duì)12.7%±0.2%，t=25.74，P ＜0.01)，表明干擾 hnRNPA1表達(dá)能抑制BGC-823細(xì)胞凋亡。

圖5 兩株BGC-823細(xì)胞侵襲能力比較(Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)晶紫染色，×20)

圖6 兩株BGC-823細(xì)胞凋亡情況比較(Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞分析)

討 論

研究表明hnRNPA1能通過(guò)與mRNA結(jié)合以及調(diào)節(jié)pre-mRNA的剪接位點(diǎn)影響細(xì)胞生物學(xué)功能，其突變或缺失與多種疾病以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道hnRNPA1在人散發(fā)性結(jié)直腸癌［6］、肝癌［7，8］、非小細(xì)胞肺癌［9］、乳腺癌［10］等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)。hnRNPA1可與含端粒重復(fù)序列的 RNA(telomeric repeat-containing RNA，TERRA)結(jié)合或與端粒DNA序列結(jié)合，既可減弱由TERRA介導(dǎo)的端粒酶抑制，又可在數(shù)量多于TERRA的情況下抑制端粒延長(zhǎng)，與TERRA一起像開關(guān)一樣調(diào)控端粒酶活性和端粒長(zhǎng)度［11］。Ushigome 等［6］發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌細(xì)胞中hnRNPA1過(guò)表達(dá)可維持端粒重復(fù)序列長(zhǎng)度，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。Hiyama等［12］對(duì)66例胃癌原發(fā)灶的分析顯示其中85%存在端粒酶活性，而鄰近正常胃黏膜僅6%顯示端粒酶活性且均為弱陽(yáng)性，絕大多數(shù)檢出端粒酶活性的胃癌體積較大并處于進(jìn)展期，端粒酶陽(yáng)性者生存期顯著短于端粒酶陰性者。該研究結(jié)果表明端粒酶激活是胃癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，由此推測(cè)hnRNPA1可能與胃癌相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1的hnRNPA1蛋白表達(dá)水平明顯低于高、中、低分化人胃癌細(xì)胞株 MKN-28、SGC-7901和BGC-823，證實(shí)hnRNPA1在惡性腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)。

已知腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)主要通過(guò)需氧糖酵解供能，同時(shí)腫瘤細(xì)胞可利用需氧糖酵解途徑的中間產(chǎn)物進(jìn)行合成代謝，促使細(xì)胞快速增殖，hnRNPA1在葡萄糖代謝氧化磷酸化與需氧糖酵解的轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用［13］。David等［14］的研究表明，腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的原癌基因c-Myc可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)hnRNPA1表達(dá)，hnRNPA1通過(guò)調(diào)控丙酮酸激酶M型同工酶(PKM)pre-mRNA的剪接位點(diǎn)以提高PKM2(胚胎型，促進(jìn)需氧糖酵解)/PKM1(成人型，促進(jìn)氧化磷酸化)比例，從而促進(jìn)需氧糖酵解和腫瘤細(xì)胞增殖。除參與調(diào)節(jié)pre-mRNA和mRNA外，hnRNPA1對(duì)NF-κB依賴性轉(zhuǎn)錄活性亦具有調(diào)控作用。NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子參與了機(jī)體內(nèi)多種生物學(xué)應(yīng)答，如免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，并通過(guò)調(diào)節(jié)增殖、遷移、凋亡相關(guān)基因表達(dá)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，多種人類惡性腫瘤中存在NF-κB異?；蚪M成性激活［15］。Hay 等［16］的研究中，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明NF-κB抑制蛋白 α(IκBα)在胞質(zhì)內(nèi)可直接與hnRNPA1特異性結(jié)合而降解，導(dǎo)致NF-κB依賴性轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，hnRNPA1缺失的細(xì)胞NF-κB依賴性轉(zhuǎn)錄活性亦缺失，而恢復(fù)hnRNPA1表達(dá)可恢復(fù)NF-κB對(duì)相關(guān)信號(hào)的有效應(yīng)答。

Li等［7］發(fā)現(xiàn)以RNA干擾技術(shù)下調(diào)hnRNPA1表達(dá)，人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖和遷移能力均受抑，過(guò)表達(dá)hnRNPA1則能增強(qiáng)正常人肝細(xì)胞株HL-7702的增殖和遷移能力。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)靶向干擾hnRNPA1表達(dá)可顯著抑制hnRNPA1高表達(dá)人胃癌細(xì)胞株BGC-823的增殖和遷移能力，提示hnRNPA1能促進(jìn)人胃癌細(xì)胞增殖和遷移。

Zhou等［8］對(duì)人肝癌細(xì)胞株和肝細(xì)胞癌組織的研究顯示，敲除高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株的hnRNPA1表達(dá)可顯著降低其侵襲能力，上調(diào)低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株的hnRNPA1表達(dá)則可顯著增強(qiáng)其侵襲能力，hnRNPA1系通過(guò)調(diào)節(jié)CD44v6表達(dá)而發(fā)揮其促侵襲作用;hnRNPA1高表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者總生存期短，復(fù)發(fā)率高。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)以RNA干擾技術(shù)下調(diào)hnRNPA1表達(dá)可使BGC-823細(xì)胞的侵襲能力顯著受抑，提示hnRNPA1能促進(jìn)人胃癌細(xì)胞侵襲。

已知水泡性口炎病毒(VSV)基質(zhì)蛋白可抑制mRNA 的核-質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，然而 Pettit Kneller等［17］對(duì) VSV感染HeLa細(xì)胞的研究卻顯示，VSV可通過(guò)mRNA輸出因子Rae1使hnRNPA1從胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)，參與VSV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;hnRNPA1表達(dá)下調(diào)后，VSV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡速度明顯減慢。但Yao等［18］報(bào)道異位表達(dá)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xL mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)可干擾核仁蛋白B23定位至胞質(zhì)并與hnRNPU、hnRNPA1形成復(fù)合體，從而增強(qiáng)mRNA合成抑制劑放線菌素D或有絲分裂阻滯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示B23/hnRNPU/hnRNPA1復(fù)合體能促進(jìn)細(xì)胞存活。由此推測(cè)，在不同作用條件下和不同環(huán)境中，hnRNPA1在細(xì)胞凋亡中所起的作用不盡相同。本實(shí)驗(yàn)以凋亡誘導(dǎo)劑H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)hnRNPA1表達(dá)受抑的BGC-823細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著降低，提示hnRNPA1對(duì)人胃癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hnRNPA1在人胃癌細(xì)胞中呈高表達(dá);以RNA干擾技術(shù)構(gòu)建靶向hnRNPA1基因的siRNA重組質(zhì)粒并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株BGC-823，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株hnRNPA1表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡均顯著受抑。鑒于人類惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移、侵襲能力密切相關(guān)，推測(cè)hnRNPA1可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用。

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