胡剛，岑東芝，楊力建，陳少華，周羽竝，李揚(yáng)秋，4

(1.廣東省惠東縣人民醫(yī)院內(nèi)一科，廣東 惠東 516300;2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所;3.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室;4.暨南大學(xué)再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

利用染色體易位形成的融合基因構(gòu)建疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異抗白血病免疫效應(yīng)，是白血病疫苗研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，這種疫苗對(duì)清除微小殘留病變，提高療效有重要作用［1－7］。DNA疫苗所包含的目的基因序列以及基因片段的大小，對(duì)于DNA疫苗的免疫效果至關(guān)重要，如何篩選出合適的抗原片段是DNA疫苗研發(fā)的一個(gè)重要內(nèi)容。為了選擇合適的PML－RARα融合基因片段用于構(gòu)建DNA疫苗，本研究選擇在PML－RARα基因融合點(diǎn)附近通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng) (reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR) 擴(kuò)增出包含融合點(diǎn)的具有不同基因序列長(zhǎng)度不同的PMLRARα融合基因片段，并利用這些融合基因片段構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒。

1 材料與方法

1.1 材料 pIRES質(zhì)粒、NB4細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存，DH5α感受態(tài)菌株購(gòu)自北京天為時(shí)代公司，內(nèi)切酶和連接酶購(gòu)自大連寶生 (TaKaRa)生物公司，Taq酶購(gòu)自 Promega公司，LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中PMLRARα基因編碼序列特點(diǎn)，按照酶切位點(diǎn)對(duì)側(cè)翼序列的要求設(shè)計(jì)包含相應(yīng)酶切位點(diǎn)的引物，引物由上海博亞生物公司合成。引物構(gòu)成如下：用于擴(kuò)增PML－RARα基因 (245 bp) 的引物 (上游引物編號(hào)為 PP1，下游引物為 PP2)：PP1：5'－TTA GCTAGC ACCATGCTGGATGGACCGCCTA－3'( 方框內(nèi)為NheⅠ酶切位點(diǎn))。PP2：5'－CAA ACGCGT CTACTCACTCAGTAGCCTGAGGACTTG－3'(方框內(nèi)為MluⅠ酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為245 bp，PCR 產(chǎn)物標(biāo)記為 PML－RARα(1)。

用于擴(kuò)增PML－RARα基因 (384 bp)的引物(上游引物編號(hào)為PP3，下游引物為PP4)：PP3：5'－CAA GCTAGC AGCATGGTCTCCAATACAACGA－3'(方框內(nèi)為 NheⅠ酶切位點(diǎn))。PP4：5'GCG ACGCGT TCAGTCCTGACAGACAAAG－3'(方框內(nèi)為MluⅠ酶切位點(diǎn))。擴(kuò)增的目的片斷長(zhǎng)度為384 bp，PCR 產(chǎn)物標(biāo)記為 PML－RARα［2］。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 從NB4細(xì)胞株中提取RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板 (NB4細(xì)胞的RNA提取和cDNA合成均按常規(guī)方法進(jìn)行)，PP1和PP2作為引物擴(kuò)增出 PML－RARα(1)，PP3和 PP4作為引物擴(kuò)增出 PML－RARα(2)。總反應(yīng)體積為 20 μl，其中含2 μl cDNA和1 U聚合酶 (Promega)，其余各試劑的終濃度為：引物 0.5 μmol/L，dNTP 0.1 mmol/L，MgCl21.5 mmol/L，1×Buffer。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀 (BioMetra)中進(jìn)行。反應(yīng)條件：首先94℃ 3 min，然后94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃1 min循環(huán)30次，最后72℃ 6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物(標(biāo)記為PCR1)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收試劑盒純化后備用。

1.2.3 pIRES－PML－RARα 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定將純化后的 PCR 產(chǎn)物 PML－RARα(1)和 PMLRARα(2)用NheⅠ和MluⅠ (TaKaRa)進(jìn)行雙酶切后分別與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的pIRES質(zhì)粒利用T4 DNA連接酶 (TaKaRa)連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌。用NheⅠ/MluⅠ雙酶切篩選出含有245 bp和382 bp的外源插入片段的陽(yáng)性克隆pIRESPML－RARα(1)和 pIRES－PML－RARα(2)。

1.2.4 重組質(zhì)粒DNA序列分析 1 μl質(zhì)粒DNA用于直接序列分析，應(yīng)用非放射性、雙脫氧核苷酸末端終止法和 Big－Dye Terminator cycle sequencing ready reaction試劑盒及3100 DNA測(cè)序儀(ABI，Perkin Elmer)進(jìn)行序列分析。

1.2.5 轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè) 利用LipofectamineTM2000 Kit轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的K562細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，分別用引物PP1、PP2(用于擴(kuò)增 PML－RARα(1)，245 bp) 和 PP3、PP4(用于擴(kuò)增 PML－RARα(2)，384 bp) 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。以轉(zhuǎn)染pIRES－PML－RARα(1)后的 K562 細(xì)胞的 RNA 和 cDNA為模板，以PP1、PP2作為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增 以NB4細(xì)胞的cDNA作為模板，分別用引物PP1、PP2和PP3、PP4進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出兩種不同長(zhǎng)度的PML－RARα基因片段，其大小分別為245 bp和384 bp，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1、圖2所示，產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 PML－RARα(1)基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 構(gòu)建的pIRES－PMLRARα(1)重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)NheⅠ和MluⅠ雙酶切鑒定證明有大小為245 bp的外源插入片段 (圖3)。構(gòu)建的 pIRES－PML－RARα(2)重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò) Nhe Ⅰ和MluⅠ雙酶切鑒定證明有大小為384 bp的外源插入片段 (圖4)。

圖2 PML－RARα(2)基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 序列分析結(jié)果 序列分析結(jié)果證實(shí)重組質(zhì)粒中外源插入片段分別與GenBank中各種不同長(zhǎng)度的PML－RARα基因序列完全一致，重組質(zhì)粒pIRES－PML－RARα(1)測(cè)序結(jié)果見圖 5，重組質(zhì)粒pIRES－PML－RARα(2)測(cè)序結(jié)果見圖 6。

2.4 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)外源質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的K562細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，用于擴(kuò)增PML－RARα基因，PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了各種重組質(zhì)粒的K562細(xì)胞的cDNA中均含有相應(yīng)的目的基因，提示這些質(zhì)粒都已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)染到了K562細(xì)胞中，并且能夠在細(xì)胞中進(jìn)行正常轉(zhuǎn)錄。

以轉(zhuǎn)染 pIRES－PML－RARα(1)后的 K562 細(xì)胞的RNA和cDNA為模板，分別以PP1、PP2作為引物，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果見圖7。圖中曲線A代表cDNA模板的檢測(cè)結(jié)果，曲線B代表RNA模板的檢測(cè)結(jié)果。從該圖中可以看到對(duì)于同一種標(biāo)本，以cDNA為模板的PCR體系熒光信號(hào)開始出現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)的循環(huán)數(shù)比以RNA為模板的PCR體系少，即前者的Ct值比后者要低 (Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的閾值所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù))。說(shuō)明cDNA模板中含有的相應(yīng)目的基因拷貝數(shù)要高于RNA模板，而這是因?yàn)閏DNA模板中含有被轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的目的基因的cDNA所致。

圖7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

利用白血病融合基因構(gòu)建DNA疫苗，是當(dāng)前疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。利用BCR－ABL融合基因構(gòu)建的DNA疫苗，可以體外誘導(dǎo)特異性抗白血病效應(yīng)［1，5］。由于許多急性早幼粒細(xì)胞白血病 (acute promyelocytic leukemia，APL)患者體內(nèi)存在 t(15;17) (q22;q21)，形成 PML－RARα 融合基因。有研究發(fā)現(xiàn)含有PML－RARα融合基因的細(xì)胞可誘導(dǎo)T細(xì)胞克隆性增殖［6］，該現(xiàn)象提示 PMLRARα融合蛋白可以被MHC分子加工提呈，因此可以利用PML－RARα融合基因誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)APL細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。Osman等［2］利用 PMLRARα融合蛋白誘導(dǎo)PML－RARα肽特異的CD4+或CD8+CTL。Padua 等［3］應(yīng)用 PML－RARα 融合基因制備的DNA疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出了特異性免疫保護(hù)作用。在構(gòu)建DNA疫苗時(shí)，DNA疫苗所包含的目的基因序列以及基因片段的大小，對(duì)于DNA疫苗的免疫效果至關(guān)重要，如何篩選出合適的抗原片段是DNA疫苗研發(fā)的一個(gè)重要內(nèi)容。為了比較包含不同長(zhǎng)度PML－RARα基因片段的DNA疫苗的免疫效果，本研究嘗試構(gòu)建了包含245 bp和384bp 的 pIRES－PML－RARα(1)和 pIRES－PMLRARα(2)真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)序列分析證明了該克隆的正確性，并且該質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄。本研究的進(jìn)一步目的在于篩選出用于構(gòu)建DNA疫苗的合適的PML－RARα基因片段，下一步我們還將在PML－RARα基因融合點(diǎn)附近擴(kuò)增出不包含融合點(diǎn)的PML－RARα基因片段用于構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將這些質(zhì)粒與我們前期已經(jīng)構(gòu)建成功的質(zhì)粒進(jìn)行小鼠體內(nèi)試驗(yàn)，以篩選出具有最佳免疫原性的PML－RARα基因片段，從而為治療APL的DNA疫苗研發(fā)提供重要資料。

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