汪 輝 夏立新 彭新凱 王玉枝 楊彥寧 李 莎

（1.長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410082）

烏洛托品學(xué)名六亞甲基四胺，白色結(jié)晶粉末或無(wú)色有光澤晶體，幾乎無(wú)臭，用作樹(shù)脂和塑料的固化劑、橡膠的硫化促進(jìn)劑（促進(jìn)劑H）、紡織品的防縮劑，并用于生產(chǎn)殺菌劑、炸藥等［1，2］。烏洛托品水解會(huì)生成甲醛和氨氣。一些不法商人利用這一性質(zhì)和甲醛的強(qiáng)殺菌、防腐且能改善外觀和質(zhì)地的作用，將烏洛托品應(yīng)用于食品的生產(chǎn)，其水解后產(chǎn)生的甲醛使成品色澤光亮，保質(zhì)期長(zhǎng)，以欺騙消費(fèi)者。消費(fèi)者食用甲醛后會(huì)引起胃痛、嘔吐和呼吸困難，并對(duì)肝臟、腎臟、中樞神經(jīng)造成損害，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致癌變和畸形病變［3］。目前有報(bào)道［4］稱不法分子將烏洛托品添加到腐竹中，以延長(zhǎng)保質(zhì)期，使其色澤光亮。腐竹加工過(guò)程中添加烏洛托品類似奶粉中添加三聚氰胺，已成為行業(yè)中的“潛規(guī)則”。

2011年衛(wèi)生部公布了《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》（第1～5批），其中包括烏洛托品，目前尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，僅有關(guān)于檢測(cè)動(dòng)物源食品的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，且只適用于雞肉、雞肝臟、雞腎臟和豬肉中烏洛托品殘留量的檢測(cè)和確證。因此建立快速測(cè)定食品中烏洛托品的檢測(cè)方法迫在眉睫。

目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的關(guān)于烏洛托品的檢測(cè)方法主要有Nesslerization（奈 氏 比 色 法）［5］、電 位 滴 定 法［6］、電 導(dǎo) 滴 定法［7］、分光光度法［8］、極譜法［9］、高效液相色譜法［10－12］、氣相色譜法［13，14］、高效液相質(zhì)譜串聯(lián)質(zhì)譜法［15］。這些方法大部分是藥物中烏洛托品的檢測(cè)方法，關(guān)于食品中的烏洛托品的檢測(cè)方法甚少，其中黃春國(guó)［14］采用氣相色譜法測(cè)定腐竹中的烏洛托品，最低檢出濃度為0.7mg／kg，SN／T 2226——2008《進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中烏洛托品殘留量的檢測(cè)方法液相色譜－質(zhì)譜／質(zhì)譜法》采用高效液相質(zhì)譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定進(jìn)出口動(dòng)物源食品中烏洛托品藥物殘留，測(cè)定低限為5μg／kg。

烏洛托品易水解，所以穩(wěn)定性試驗(yàn)對(duì)建立檢測(cè)食品中烏洛托品的方法至關(guān)重要。通常，穩(wěn)定性試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成一定濃度的溶液做正交試驗(yàn)，在不同條件下分析其濃度變化。當(dāng)然穩(wěn)定性試驗(yàn)中烏洛托品濃度的變化并不能代替樣品中烏洛托品濃度的變化，但它可以為樣品前處理和分析提供相關(guān)信息，如烏洛托品在酸性溶液中更易水解和在乙腈溶液中較穩(wěn)定等。這些信息讓我們進(jìn)一步了解了烏洛托品在食品中的含量變化，也為提高質(zhì)譜分析方法的靈敏度和更好地優(yōu)化前處理方法提供向?qū)А?/p>

本試驗(yàn)對(duì)高效液相色譜條件、特征離子選擇、前處理方法技術(shù)等方面進(jìn)行了優(yōu)化，采用無(wú)水硫酸鈉干燥凈化，乙腈提取，建立了高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中的烏洛托品的定性和定量的分析方法。該方法靈敏度高，前處理簡(jiǎn)單，分析周期短，能夠有效地及時(shí)監(jiān)控食品中違法添加的烏洛托品。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

烏洛托品：純度≥99.0%，美國(guó)Sigma公司；

甲醇、乙腈：色譜純，德國(guó)Merck公司；

醋酸銨（純度≥98%）、醋酸（純度≥99.5%）、甲酸（純度為98%）、乙醚：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙醇（純度為95%）：分析純，安徽安特食品有限公司；

Agilent Triple Quad LC／MS：6410型，配有電噴霧（ESI）離子源，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

高分離度快速液相色譜儀：1200型，配在線脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

超聲清洗器：KQ3200型，昆山超聲儀器有限公司；

氮吹儀：N－EVAP－45型，美國(guó)Organomation有限公司；

全自動(dòng)六通道固相萃取裝置：FOTECTOR－06C型，美國(guó)?？苾x器有限公司；

超純水處理器：A10型，美國(guó)密理博公司；

水浴恒溫震蕩器：SHA－B型，江蘇金壇醫(yī)療儀器廠；

快速混勻器：SK－1型，江蘇金壇醫(yī)療儀器廠；

臺(tái)式高速離心機(jī)：CT14D型，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)烏洛托品于100mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，使成為100mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度使成為1mg／L標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于4℃下避光保存。再逐級(jí)稀釋配制成質(zhì)量濃度為1～500μg／L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，待用。

1.3 LC－MS／MS分析條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱為 Agilent Zorbax 300－SCX色譜柱（150mm×2.1mm，5μm i.d.）；柱溫為40 ℃；流速為0.4mL／min；流動(dòng)相 A 為0.01mol／L 醋酸銨（冰醋酸調(diào)pH＝3.5），B為乙腈，線性梯度洗脫程序：0～3min，70%A，3～5min，由70%A線性降至20%A，5～8min，20%A，8～8.01min，由20%A線性升至70%A，進(jìn)樣量10μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；ESI模式：正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：4 000V；霧化器（N2）壓力：2.8×105Pa；干燥氣體（N2）溫度：350℃；干燥氣體（N2）流速：9L／min；其他參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 烏洛托品的MS／MS參數(shù)?Table 1 MS／MS parameters of methenamine

1.4 樣品處理

1.4.1 前處理方法1 準(zhǔn)確稱取3.0g樣品于50mL離心管中，加無(wú)水硫酸鈉2.0g，加入乙腈10mL，渦旋混勻2min（含油脂樣品加入5mL乙腈飽和正己烷溶液去油），高速離心（10 000r／min，5min），取上清液過(guò)0.22μm 尼龍濾膜，濾液待用。

1.4.2 前處理方法2 提取同“前處理方法1：準(zhǔn)確稱取……高速離心（10 000r／min，5min）”后，轉(zhuǎn)移全部乙腈溶液于10mL比色管中，50℃下氮?dú)獯蹈?，?mL 0.02mol／L醋酸銨溶解殘?jiān)芤捍谩?/p>

依次用3mL甲醇、3mL 0.02mol／L醋酸銨溶液活化PCX固相萃取柱，準(zhǔn)確移取待測(cè)溶液上柱，控制過(guò)柱速度在1mL／min以內(nèi)，再分別用2mL 0.02mol／L醋酸銨溶液、2mL甲醇淋洗PCX固相萃取柱，抽干后用3mL 5% 氨水－乙腈洗脫，洗脫液在50℃下氮?dú)獯抵两?，?zhǔn)確加入1mL乙腈，在快速混勻器上混勻1min，經(jīng)0.22μm尼龍濾膜過(guò)濾，濾液待分析［14，16］。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

毛細(xì)管電壓、霧化器（N2）壓力、干燥器（N2）溫度和干燥器（N2）流速的參數(shù)均參照安捷倫科技有限公司提供的參考值確定。在流動(dòng)注射條件和正離子模式下，用濃度為1mg／L的烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行母離子掃描，優(yōu)化毛細(xì)管出口電壓參數(shù)值，再使用優(yōu)化好的參數(shù)進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量參數(shù)值（見(jiàn)表1）。為了滿足歐盟2002／65／EC指令規(guī)定，對(duì)于禁用藥物的質(zhì)譜確證方法至少需要4個(gè)確證點(diǎn)［17］，選擇了目標(biāo)化合物豐度較高，干擾較小的子離子m／z 112，98，85，42進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，以m／z 42為定量離子，其可能裂解方式見(jiàn)圖1。

圖1 烏洛托品的質(zhì)譜裂解圖Figure 1 The proposed fragmentation pathways for methenamine

2.2 色譜分離條件的優(yōu)化

考察乙腈－醋酸銨（pH＝6.8）、乙腈－醋酸銨（冰醋酸調(diào)pH＝5.0）、乙腈－醋酸銨（冰醋酸調(diào)pH＝3.5）作為流動(dòng)相體系。乙腈－醋酸銨（pH＝6.8）作為流動(dòng)相時(shí)，烏洛托品保留時(shí)間為1.5min左右，峰型發(fā)生嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象。隨著流動(dòng)相的pH值降低，烏洛托品的保留值也隨之增大，拖尾現(xiàn)象也隨之緩解，采用乙腈－醋酸銨（pH＝3.5）作為流動(dòng)相時(shí)，烏洛托品的峰型對(duì)稱，保留時(shí)間為10min以內(nèi)，較為合理。因此，最終采用乙腈－醋酸銨（pH＝3.5）作為分析烏洛托品的流動(dòng)相。

確定流動(dòng)相體系后，采用梯度洗脫方式，可以使分析速度加快，有較好的信號(hào)響應(yīng)，而且避免了內(nèi)源物質(zhì)的干擾［18］?？疾炝肆鲃?dòng)相0.01mol／L醋酸銨（pH＝3.5）初始比例：80%，70%，60%，50%，按 1.3.1 中 梯 度 洗 脫 時(shí) 間，0.01mol／L醋酸銨（pH＝3.5）均降至最低比例（為20%）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相0.01mol／L醋酸銨（pH＝3.5）初始比例為80%時(shí)，響應(yīng)值最低，其它比例對(duì)烏洛托品的分離及響應(yīng)影響不明顯，為了確保流動(dòng)相足夠的離子強(qiáng)度和烏洛托品的響應(yīng)值，最終選擇70%的0.01mol／L醋酸銨（pH＝3.5）作為流動(dòng)相的初始比例。

確定初始比例后，按1.3.1中梯度洗脫時(shí)間，考察了流動(dòng)相0.01mol／L醋酸銨（pH＝3.5）最終降至的最低比例：40%，30%，20%，10%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏洛托品的響應(yīng)值、保留時(shí)間、峰寬均隨著0.01mol／L醋酸銨（pH＝3.5）比例降低而增大，為確保足夠的響應(yīng)值和尖銳的峰型，最終選擇20%的0.01mol／L醋酸銨（pH＝3.5）作為流動(dòng)相降至的最低比例。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

為更好地了解烏洛托品的穩(wěn)定性，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩個(gè)正交試驗(yàn)。

第一個(gè)采用L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，考察烏洛托品隨著濃度、時(shí)間、溶劑和儲(chǔ)存環(huán)境4個(gè)因素發(fā)生的變化［19－21］。因素水平表見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)及結(jié)果分析表見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test on autolysis conditions

表3 正交試驗(yàn)L9（34）的結(jié)果Table 3 Arrangement and results of L9 （34）orthogonal test

由表3可知，影響烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液穩(wěn)定性的因素順序?yàn)锳＞B＞D＞C。最優(yōu)組合為A3B1C3D2。烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液濃度越大，時(shí)間越短越穩(wěn)定，采用乙腈溶解，冷藏儲(chǔ)存較穩(wěn)定。

烏洛托品溶液被不法份子用來(lái)浸泡食品，會(huì)產(chǎn)生刺鼻的氣味。這是因?yàn)闉趼逋衅匪鈺?huì)生成甲醛。從化學(xué)平衡反應(yīng)方程式（1）可知，增加H＋濃度則促進(jìn)烏洛托品的水解，增加OH－或濃度則會(huì)抑制烏洛托品水解。

由于食品品種不同，不法分子采用烏洛托品溶液濃度、浸泡的時(shí)間、酸堿性均不同。模擬食品加工過(guò)程烏洛托品的穩(wěn)定性，烏洛托品溶液隨著濃度、浸泡時(shí)間、酸堿性3個(gè)因素發(fā)生的變化。因素水平表見(jiàn)表4，正交試驗(yàn)及結(jié)果分析表見(jiàn)表5。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal test on autolysis conditions

表5 正交試驗(yàn)L9（33）的結(jié)果Table 5 Arrangement and results of L9（33）orthogonal test

由表5可知，影響因素對(duì)烏洛托品穩(wěn)定性影響大小分別為C＞B＞A，最優(yōu)組合為A2B1C3，其測(cè)定結(jié)果與原始濃度幾乎一致。在第5天對(duì)這9組溶液進(jìn)行后續(xù)測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)烏洛托品含量最低降至原來(lái)的1%左右。此結(jié)果可為測(cè)定烏洛托品前處理優(yōu)化提供指導(dǎo)，也說(shuō)明用烏洛托品溶液浸泡過(guò)后的食品中烏洛托品的含量會(huì)因?yàn)閮?chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而變得非常低，因此要測(cè)定食品在加工過(guò)程中是否添加烏洛托品需要采用靈敏度非常高的檢測(cè)方法，本文建立的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中的烏洛托品，具有高靈敏度，快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，完全滿足食品中烏洛托品的定性和定量的測(cè)定。

2.4 樣品前處理的選擇

對(duì)比了前處理方法1和2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)方法2因?yàn)檫^(guò)固相萃取柱的過(guò)程中使用了醋酸銨－水溶液，使得部分烏洛托品水解，且操作步驟較方法1繁瑣，商用固相萃取柱批量差異和個(gè)體差異以及過(guò)柱過(guò)程中人為因素影響較大，導(dǎo)致結(jié)果的回收率較低（均小于50%）且重復(fù)性差（RSD最高達(dá)22%）。由于質(zhì)譜的高選擇性，加之本方法采用多個(gè)子離子定性，可以有效地消除由于乙腈溶液直接提取且沒(méi)有凈化可能會(huì)使樣品色譜圖有背景干擾的現(xiàn)象。將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至采用方法1處理的樣品溶液中，與相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比響應(yīng)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯離子抑制現(xiàn)象。故本方法采用方法1進(jìn)行樣品提取。

2.5 質(zhì)譜定性與定量

烏洛托品易水解，同一樣品在不同時(shí)間測(cè)定，結(jié)果可能不一致。因此，測(cè)定烏洛托品質(zhì)譜定性較定量重要。在相同的儀器條件下，采用雙重定性法進(jìn)行定性，即樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖保留時(shí)間一致，且樣品質(zhì)譜圖在扣除背景后所選擇的離子均出現(xiàn)，所選擇的離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品一致（相對(duì)豐度＞50%，20%～50%，10%～20%，≤10%時(shí)，允許的偏差分別為20%，25%，30%，50%），則可判定樣品中存在烏洛托品［16，22］。試驗(yàn)監(jiān)測(cè)了烏洛托品母離子141，子離子112，98，85，42，比較了混合空白加標(biāo)樣品溶液各離子的豐度比（見(jiàn)表6）。由表6可知，混合空白加標(biāo)樣品溶液的變異系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)偏差和豐度比均得到滿意的結(jié)果［23］，其離子比例（±25%）為12.5%～19.6%，變異系數(shù)（≤15%）為2.4%～13.6%，其典型的圖譜見(jiàn)圖2。定量分析采用外標(biāo)曲線法。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 線性關(guān)系、線性范圍、檢出限、定量限、精密度 將烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)中間溶液用乙腈稀釋成1，2，5，10，20，50，100，200，500，1 000μg／L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，過(guò)0.22μm尼龍濾膜后，直接上機(jī)測(cè)定，以質(zhì)量濃度X （μg／L）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，烏洛托品在濃度為1～1 000μg／L中線性良好，線性方程為Y＝4.81×102X－6.60×103，r2＝0.998 8。取空白樣品基質(zhì)溶液進(jìn)行分析，以3倍信噪比（S／N）確定方法的檢測(cè)限為0.2μg／kg，以10倍信噪比 （S／N）確定方法的定量限為1.0μg／kg。取濃度為100μg／L標(biāo)準(zhǔn)溶液和隨機(jī)取1份加標(biāo)樣品分別重復(fù)進(jìn)樣6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.12%和3.63%，表明儀器具有良好的精密度。

2.6.2 回收率和精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定方法回收率，以魚(yú)仔熟食、濕米粉、腐竹為空白樣品基質(zhì)，分別添加3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)，典型圖譜見(jiàn)圖3，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，樣品加標(biāo)回收率在52.6%～118%，RSD小于10.2%。

2.7 干擾試驗(yàn)

為了考察食品中可能違法添加的三聚氰胺、雙氰胺和食品中本身含有的多胺類物質(zhì)，對(duì)腐胺、精胺是否干擾烏洛托品進(jìn)行測(cè)定。取三聚氰胺、雙氰胺、腐胺和精胺標(biāo)準(zhǔn)品配制成5，50，200μg／L的溶液進(jìn)樣分析；再制成相應(yīng)濃度的混合樣品進(jìn)樣分析。試驗(yàn)結(jié)果表明：在本實(shí)驗(yàn)所建立的色譜和質(zhì)譜條件下，三聚氰胺、雙氰胺、腐胺和精胺均未檢出，表明上述成分對(duì)所建立的烏洛托品測(cè)定方法無(wú)干擾［24－26］。將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至上述溶液中，與相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比響應(yīng)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有三聚氰胺、雙氰胺、腐胺和精胺的樣品溶液對(duì)測(cè)定烏洛托品無(wú)明顯基質(zhì)干擾。

圖2 典型總離子色譜圖（TIC）和診斷離子色譜圖（EIC）Figure 2 The typical total Ion chromatorgraphy and extracted ion chromatogram

表6 LC－MS／MS對(duì)樣品中烏洛托品的確證分析?Table 6 Summary of confirmation analysis in samples by LC－MS／MS

圖3 樣品典型色譜圖Figure 3 The typical chromatography of samples

表7 樣品加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果Table 7 Results of recovery test（n ＝6）

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)市場(chǎng)抽檢的采用國(guó)標(biāo)測(cè)定含有甲醛的魚(yú)仔熟食、雞爪熟食、墨魚(yú)干、魷魚(yú)干、堿面、濕米粉和不含有甲醛的豬肉、腐竹八類產(chǎn)品進(jìn)行烏洛托品含量的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞爪熟食中含有0.033mg／kg烏洛托品，其它食品均未檢出烏洛托品，但不能排除含有甲醛的樣品未添加烏洛托品，因?yàn)樘砑拥臑趼逋衅酚锌赡芩馔耆?。因此，食品中的烏洛托品必須先從食品的生產(chǎn)環(huán)節(jié)監(jiān)測(cè)，以流通環(huán)節(jié)輔之。

表8 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果?Table 8 Results of practical samples（n ＝3）／（mg·kg－1）

3 結(jié)論

建立了液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中烏洛托品的分析方法，采用無(wú)水硫酸鈉干燥除水，乙腈溶液提取，以0.01mol／L醋酸銨（pH＝3.5）－乙腈溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，SCX色譜柱進(jìn)行分離，ESI＋／MS進(jìn)行定性定量檢測(cè)。本方法快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)，靈敏度高，樣品前處理簡(jiǎn)便易行，分析周期短，適合大量樣品的測(cè)定，可用于監(jiān)測(cè)食品中烏洛托品，保護(hù)消費(fèi)者健康。

1 王箴.化工辭典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：964.

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