徐金升 白亞玲 張俊霞 崔立文 張慧然 張勝雷

EphrinA1-Fc對(duì)人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞EphA2和ERK表達(dá)影響的研究*

徐金升 白亞玲 張俊霞 崔立文 張慧然 張勝雷

目的：探討EphrinA1-Fc對(duì)人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞系促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體A2（EphA2）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）磷酸化程度的影響。方法：應(yīng)用可溶性配體EphrinA1-Fc干預(yù)人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞系，采用Wstern blot方法分析不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)EphA2和ERK1/2的磷酸化程度。結(jié)果：EphrinA1-Fc干預(yù)5、10、30、60 min后，p-EphA2、p-ERK的相對(duì)表達(dá)量逐漸增加（F=9.392，P=0.025；F=4.428，P=0.041），p-EphA2、p-ERK在EphrinA1-Fc干預(yù)前均未見表達(dá)。結(jié)論：EphrinA1-Fc抑制腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的可能機(jī)制之一是其促使腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞EphA2磷酸化而導(dǎo)致其降解實(shí)現(xiàn)。

EphrinA1-Fc 腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O EphA2 ERK 磷酸化

受體酪氨酸蛋白激酶是外界刺激信息傳遞至細(xì)胞核，轉(zhuǎn)化成細(xì)胞效應(yīng)信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分，參與細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)化及胚胎發(fā)育和腫瘤形成，具有重要生理功能。促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體（erythropoietin producing hepatocellular receptor，Eph）家族是一類新發(fā)現(xiàn)的酪氨酸蛋白激酶受體（receptor tyrosine kinase，RTK），近年來其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中所起的作用備受關(guān)注［1-2］。EphA2是其中最早被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)成員，正常情況下，EphA2與其配體EphrinA1結(jié)合后導(dǎo)致二者均發(fā)生酪氨酸磷酸化而產(chǎn)生雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過其下游信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞正常的生長、發(fā)育，同時(shí)也促進(jìn)EphA2受體自身降解。但在腫瘤組織中，因EphA2定位異常，不能與其配體正常結(jié)合，導(dǎo)致其無法正常降解而在腫瘤組織中異常堆積，促使腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。Nakamura等［3］研究顯示用EphA2人工可溶性配體EphrinA1-Fc刺激胃癌細(xì)胞系可以導(dǎo)致EphA2蛋白表達(dá)降低以及EphA2磷酸化水平增加，并能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長。但目前有關(guān)EphrinA1-Fc對(duì)腎癌細(xì)胞系影響的研究報(bào)道較少，本研究就EphrinA1-Fc對(duì)人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞EphA2和ERK1/2磷酸化的影響進(jìn)行探討，以明確其抗腫瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 裸鼠 SPF（無特定病原體）級(jí)雌性BALB/c-nu/nu小鼠8只，4～6周齡，體質(zhì)量16～20 g，購自北京康藍(lán)生物科技有限公司。BALB/c-nu/nu小鼠在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可。

1.1.2 主要儀器和試劑 EphA2、ERK1、ERK2兔抗人多克隆抗體及p-ERK鼠抗人單克隆抗體均購自Santa Cruz公司（美國），APDH兔抗人多克隆抗體購自上海晶美公司，重組鼠抗人EphrinA1-Fc嵌合體購自SYSTEMS公司（英國），IgG-Fc購自Jackson Immunoresearch Laboratiries Inc公司（美國），鼠抗人磷酸化酪氨酸單克隆抗體購自Cell Signaling公司（英國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞系由上海中科院細(xì)胞庫提供。人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞系使用含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2、濕度飽和的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，每1～2天更換培養(yǎng)液1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，分別用EphrinA1-Fc和IgG-Fc進(jìn)行干預(yù)。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型建立 收集對(duì)數(shù)生長期的腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞株，1 000 r/min離心5 min，制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度為3×107/mL。用1 mL空針將細(xì)胞懸液注入裸鼠左、右腋皮下，0.2 mL/只，含細(xì)胞數(shù)6×106個(gè)，接種后觀察注射部位出現(xiàn)結(jié)節(jié)時(shí)間。待裸鼠生長至接種后8周，出現(xiàn)清楚腫瘤界限，將接種成功的8只裸鼠隨機(jī)分為2組，4只/組。實(shí)驗(yàn)組：腫瘤周圍注射EphrinA1-Fc（2 mg/mL），0.1 mL/次，3次/周；對(duì)照組：注射IgG-Fc，0.1 mL/次，3次/周。實(shí)驗(yàn)于腫瘤細(xì)胞接種12周結(jié)束，干預(yù)治療時(shí)間為4周。4周后取出瘤組織，福爾馬林固定、石蠟包埋，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Wstern blot 將收集的細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液200 μL混勻，冰上靜置30 min，4℃，11 000 r/min離心20 min，取其上清即為細(xì)胞總蛋白，測定細(xì)胞總蛋白的濃度。加入蛋白40 μg/孔，10%SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉的TTBS室溫封閉1 h，一抗稀釋于封閉液中，4℃搖晃過夜，TTBS漂洗3次，二抗稀釋于封閉液中，室溫?fù)u晃1 h，TTBS漂洗3次。蛋白信號(hào)由DAB試劑盒檢測。采用美國Kodak公司D凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)各區(qū)帶進(jìn)行定量分析。

1.2.4 EphA2免疫組織化學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn) 按照S-P試劑盒說明書進(jìn)行，EphA2免疫組織化學(xué)染色以胞漿或胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。結(jié)果由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師獨(dú)立雙盲評(píng)估，每張切片至少觀察200個(gè)目的細(xì)胞的免疫反應(yīng)情況，在高倍視野（×400）下觀察每個(gè)目的細(xì)胞的染色強(qiáng)度并進(jìn)行評(píng)分。陰性為0分（未著色），弱陽性為1分（淺黃色），陽性為2分（黃色），強(qiáng)陽性為3分（黃褐色）。計(jì)算每張切片的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，陽性細(xì)胞率（%）=（≥1分細(xì)胞數(shù)量）/（觀察細(xì)胞總數(shù)）×100%。按文獻(xiàn)報(bào)道的方法［4-5］計(jì)算每張切片的HSCORE分值。HSCORE=（i+1）π，其中i代表細(xì)胞染色的陽性強(qiáng)度（陽性強(qiáng)度采用0、1、2、3分表示），π代表陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)（采用0～100%表示）。HSCORE分值＞100%為高表達(dá)，≤100%為低表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EphrinA1-Fc干預(yù)后腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

正常條件下培養(yǎng)的人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞接受可溶性配體EphrinA1-Fc刺激1 min，細(xì)胞形態(tài)即發(fā)生改變，細(xì)胞由梭形伸展?fàn)顟B(tài)開始回縮；5 min時(shí)部分細(xì)胞變圓；30 min時(shí)90%細(xì)胞變圓，與瓶壁結(jié)合疏松；40 min時(shí)部分細(xì)胞重新伸展、粘附于瓶壁；60 min時(shí)90%細(xì)胞恢復(fù)到刺激前狀態(tài)，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)學(xué)未發(fā)生明顯變化。

2.2 EphrinA1-Fc對(duì)人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞內(nèi)EphA2和p-EphA2、ERK和p-ERK表達(dá)的影響

EphrinA1-Fc干預(yù)5、10、30、60 min后，p-EphA2相對(duì)表達(dá)量（p-EphA2/EphA2比值）在5 min時(shí)開始出現(xiàn)，并逐漸增高，30 min時(shí)達(dá)最高。EphrinA1-Fc干預(yù)前未見p-EphA2表達(dá)（P＞0.05）。p-ERK的相對(duì)表達(dá)量（p-ERK與ERK1/2比值）在5 min時(shí)開始出現(xiàn)，并逐漸增高，30 min時(shí)達(dá)最高。EphrinA1-Fc干預(yù)前未見p-ERK表達(dá)（圖1，2）。

2.3 EphrinA1-Fc對(duì)裸鼠人腎癌細(xì)胞移植瘤體積及移植瘤EphA2表達(dá)的影響

EphrinA1-Fc干預(yù)治療4周后，移植瘤體積較對(duì)照組明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：EphA2蛋白陽性表達(dá)于胞漿或胞膜，實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織內(nèi)EphA2蛋白高表達(dá)率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4，表1）。

圖1 Western blot檢測EphrinA1-Fc干預(yù)腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞后胞漿內(nèi)p-EphA2、EphA2、p-ERK和ERK1/2表達(dá)情況Figure 1 Expression of p-EphA2，EphA2，p-ERK，and ERK1/2 in the renal clear cells 786-O stimulated by EphrinA1-Fc（Western blot）

圖2 EphrinA1-Fc干預(yù)腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞后胞漿內(nèi)p-EphA2、p-ERK相對(duì)表達(dá)量Figure 2 Comparison of the expression of p-EphA2，EphA2，p-ERK，and ERK1/2 in the renal clear cells 786-O stimulated by EphrinA1-Fc

圖3 EphrinA1-Fc和IgG-Fc干預(yù)移植瘤4周前后移植瘤體積的變化Figure 3 Change in the volumes of transplanted tumor in nude mice receiving EphrinA1-Fc and IgG-Fc injection for 4 weeks

圖4 EphrinA1-Fc和IgG-Fc干預(yù)移植瘤4周后EphA2表達(dá)情況（S-P×400）Figure 4 Expression of EphA2 in the transplanted tumor stimulated by EphrinA1-Fc and IgG-Fc for 4 weeks（S-P×400）

表1 EphrinA1-Fc和IgG-Fc對(duì)移植瘤EphA2表達(dá)影響的比較Table 1 Expression of EphA2 in the transplanted tumor stimulated by EphrinA1-Fc and IgG-Fc

3 討論

本課題前期研究成果顯示：EphA2/EphrinA1在腎癌中高表達(dá)，并且隨著腎癌惡性程度的增加其表達(dá)增高。EphA2/EphrinA1在腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過程中起著重要作用［6］。近期研究發(fā)現(xiàn)，EphrinA1-Fc單克隆抗體刺激惡性腫瘤細(xì)胞能阻止腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂上聚集［7-8］。EphrinA1-Fc是EphrinA1的模擬配體，是由鼠源EphrinA1胞外區(qū)的多聚肽鏈連接到人源IgG羥基末端的Fc區(qū)域而形成［9］，EphrinA1-Fc可與腫瘤細(xì)胞膜上的EphA2受體特異性結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本研究通過觀察EphrinA1-Fc干預(yù)腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞后形態(tài)學(xué)改變，與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)EphrinA1-Fc對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用，其作用特點(diǎn)是快速而短暫。又根據(jù)EphrinA1-Fc作用的特點(diǎn)，利用EphrinA1-Fc反復(fù)干預(yù)裸鼠移植瘤，治療4周后與對(duì)照組比較，治療組的移植瘤體積明顯縮小，進(jìn)一步驗(yàn)證了EphrinA1-Fc抑制腫瘤的作用。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路代表了一連串磷酸化級(jí)聯(lián)事件，涉及3種關(guān)鍵激酶，即MAPK激酶的激酶（MAPKKK）、MAPK激酶（MAPKK）、MAPK［10］。在真核細(xì)胞中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK），JNK/SAPK及p38MAPK三條MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中JNK和p38MAPK兩條通路主要與細(xì)胞的應(yīng)激和凋亡有關(guān)；ERK（包括ERK1和ERK2）通路是細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵，其主要與細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)［11-12］。鑒于此，本研究觀察了EphrinA1-Fc對(duì)腎癌細(xì)胞EphA2和ERK及其磷酸化的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，EphrinA1-Fc干預(yù)后EphA2、ERK1/2在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)無明顯差別，而磷酸化EphA2、ERK卻不同，其磷酸化程度呈時(shí)間依賴性，隨著時(shí)間的延長，磷酸化程度逐漸增強(qiáng)，在30 min時(shí)效應(yīng)達(dá)到最大，提示EphrinA1-Fc可促使EphA2磷酸化，也提示其作用時(shí)間是快速和短暫的，此種現(xiàn)象與研究觀察的細(xì)胞形態(tài)變化是一致的，同時(shí)在裸鼠移植瘤模型上證實(shí)了EphrinA1-Fc可降低裸鼠移植瘤EphA2的表達(dá)。Yang等［13］研究發(fā)現(xiàn)，EphA2配體或抗體的刺激能快速而顯著地降低細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其近似。但本研究還發(fā)現(xiàn)EphrinA1-Fc可促使ERK發(fā)生磷酸化，ERK的磷酸化通常代表Ras/Raf/MAPK通路的激活，細(xì)胞增殖加快，粘附性增強(qiáng)，使癌細(xì)胞更容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，與EphrinA1-Fc表現(xiàn)出來的抗腫瘤效應(yīng)相矛盾，分析原因可能是EphrinA1-Fc降解EphA2而抑制細(xì)胞生長，進(jìn)而反饋性激活細(xì)胞內(nèi)Ras/Raf/MAPK通路而對(duì)抗EphrinA1-Fc抑制細(xì)胞增殖作用，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，EphrinA1-Fc通過促使腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞EphA2受體發(fā)生磷酸化而使其降解加速，下調(diào)細(xì)胞中總EphA2蛋白，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。EphrinA1-Fc有望成為特異性針對(duì)EphA2蛋白的抗腫瘤特效藥。

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（2013-03-14收稿）

（2013-06-17修回）

Effect of EphrinA1-Fc on phosphorylation of EphA2 and ERK in 786-O renal carcinoma cells

Jinsheng XU,Yaling BAI,Junxia ZHANG,Liwen CUI,Huiran ZHANG,Shenglei ZHANG

Yaling BAI;E-mail:snbyl@163.com
Department of Nephrology,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China

Objective:To detect the effect of EphrinA1-Fc on the phosphorylation of EphA2 and extracellular signal-regulated kinase(ERK)in 786-O renal carcinoma cells(RCCs).Methods:The soluble ligand EphrinA1-Fc was used to inhibit the 786-O RCCs in vitro.Western blot analysis was used to examine the phosphorylation of EphA2 and ERK1/2 in the 786-O RCCs at different time points.Results:After the intervention with EphrinA1-Fc for 5,10,30,and 60 min,the expression of p-EphA2 increased(F=9.392,P=0.025)as well as that of p-ERK(F=4.428,P=0.041).No p-EphA2 and p-ERK expression was observed in the pre-intervention group.Conclusion:One of the possible mechanisms of the inhibitory effect of EphrinA1-Fc on tumor metastasis and recurrence involves the phosphorylation of EphA2 by EphrinA1-Fc,leading to the degradation of EphA2.

EphrinA1-Fc,786-O renal carcinoma cells,EphA2,ERK,phosphorylation

10.3969/j.issn.1000-8179.20130415

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腎內(nèi)科（石家莊市050000）

*本文課題受河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：10276177）資助

白亞玲 snbyl@163.com

This work was supported by the Project of Hebei Natural Science Fund(No.10276177)

（本文編輯：張亻 刡）