陳 潔，沈如娣，王璐楠，顏烯烯，羅 振，王曉明 (臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 臺州 318000)

骨髓是造血組織，其內(nèi)存大量的造血干細胞，可以分化成多種血細胞。1976年，F(xiàn)riedenstein在其研究中發(fā)現(xiàn)，骨髓中除造血干細胞外還存在著一類易于貼附于塑料培養(yǎng)板表面的細胞，此細胞具有多分化潛能，是一種干細胞，稱為骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)［2］。有研究報道BMSCs在體外培養(yǎng)的情況下，可被誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細胞、骨細胞等多種成體細胞［3-5］。由于BMSCs的多分化干細胞特性及易獲得性，尤其是可誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細胞的特性，BMSCs在腦與神經(jīng)損傷的臨床細胞學(xué)治療中極具潛力，也是目前的研究熱點之一。目前關(guān)于誘導(dǎo) BMSCs向神經(jīng)元分化方法較多［2，4，5-7］，多為在體外培養(yǎng)體系加入不同的生長因子加入誘導(dǎo)，但誘導(dǎo)效率不一，更為高效率的誘導(dǎo)方法仍在探索中。有研究報道［6］，表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)，在體外培養(yǎng)時，可誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞在體外增殖，是一種必不可少的生長因子之一。同時亦有報道稱肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)，在體外培養(yǎng)時，可以與酪氨酸激酶受體c-Met結(jié)合從而誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞(Neuron stem cells，NSCs)存活和分化［8-9］。BMSCs具有神經(jīng)干細胞的特性，HGF是否可高效的誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化及高效的誘導(dǎo)途徑還未見報道。本實驗擬通過HGF可誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的特性，嘗試誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化，擬尋找一種更為高效的BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料:成年Wistar大鼠，購自杭州師范學(xué)院動物中心。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的獲得及鑒定:將大鼠無痛處死，去皮、肌肉，分離出股骨，去骺端后，PBS緩沖液沖洗骨髓腔，收集沖洗液，即骨髓溶液，約30 ml，并存儲在含肝素的試管中。吸管反復(fù)吹打，制備成單細胞懸液，然后緩慢加入淋巴細胞分離液(大鼠淋巴細胞分離液，Histopaque-1083，Sigma)，密度梯度離心，2000 rpm離心20 min。收集細胞分離液界面處的最上層和單個核細胞層，并用20 ml的 PBS再次混合。再次離心，1800 rpm離心5 min，此次只收集單個核細胞層。收集得到的細胞用PBS洗滌2次，1000 rpm/min離心5 min，棄上清，加入L-DMEM完全培養(yǎng)液(DMEM，10%FBS，1×青霉素 -鏈霉素)重懸細胞。然后，調(diào)細胞濃度2×105，并接種到培養(yǎng)瓶中(T-75)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液，以后每2天換液1次。由于骨髓間充質(zhì)干細胞是貼壁增殖的細胞，24 h即可貼壁，貼壁細胞多為 BMSCs。7～10 d，BMSCs增殖至80% ～90%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，流式細胞術(shù)鑒定。胰蛋白酶消化3 min左右，培養(yǎng)液終止消化，無菌吸管沖洗貼壁的骨髓間充質(zhì)干細胞，獲得的細胞懸液按1∶2傳代，培養(yǎng)7～8 d可傳代1次。傳代細胞用于誘導(dǎo)分化。

1.2.2 流式細胞儀鑒定獲得細胞為BMSCs:取傳代4代骨髓間充質(zhì)干細胞，待細胞長到近90%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化3～5 min，制成單細胞懸液并計數(shù)，取1×106個細胞，用流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞表面抗原(abcam公司)CD105-PE(Serotec公司)，CD45-FITC(BD 公司)，CD34-FITC(BD公司)，CD14-FITC(BD公司)的表達情況。具體操作按操作說明進行。

1.2.3 實驗分組:鑒定后的傳代細胞分為三組:A組，培養(yǎng)體系內(nèi)加入生長因子HGF;B組，加入EGF和HGF;C組，對照組，維持傳代培養(yǎng)時的培養(yǎng)體系(DMEM培養(yǎng)基)，不加其他誘導(dǎo)因子。當BMSCs增殖至80% ～90%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化、分離，獲得的BMSCs細胞，繼續(xù)培養(yǎng)至形成1～2簇/cm2。24 h后，當BMSCs再次貼壁，并開始在培養(yǎng)基中生長時，分別在不同組中加入適量的生長因子，培養(yǎng)基為DMEM，加入EGF 10 ng/ml(Gibco BRL，Rock ville，MD，USA)，HGF 20 ng/ml(R＆D Systems，Minneapolis，MN，USA)。換液頻次1 次/3 d，繼續(xù)培養(yǎng)14 d。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，免疫熒光染色、WB檢測BMSCs向神經(jīng)元或神經(jīng)元樣細胞分化情況。

1.2.4 免疫熒光染色技術(shù)鑒定分化細胞為神經(jīng)元或神經(jīng)元樣細胞:單孔細胞培養(yǎng)皿用于此鑒定，誘導(dǎo)分化在此培養(yǎng)皿內(nèi)時行。取此皿，分化的細胞已貼附于皿底，PBS洗滌3次，5 min/次，并用4%多聚甲醛PBS溶液固定15 min。然后將其用PBS洗滌2次，5 min/次。然后，樣品用含有1%BSA和0.2%Tri-ton X-100的PBS作用5 min。一抗4℃孵育過夜?？贵w為:Neuronal Nuclei(NeuN，1∶100，Chemicon Inc.);GFAP(1∶1000，Chemicon Inc.)。在熒光顯微鏡下觀察細胞。1.2.5 Western Blotting技術(shù)檢測分化細胞內(nèi)神經(jīng)元標志性蛋白表達情況:各組細胞經(jīng)胰酶消化，經(jīng)冷的0.01 mol/LPBS緩沖液洗3次，離心收集，加細胞裂解液(50 mM Tris-Cl，pH值 7.4，150 mM NaCl，5%NP-40，1 mM sodium pyrophosphate，2 mM EDTA等)裂解細胞(1ml細胞壓積加入6～10 ml裂解液)，輕輕吹打混勻，離心15 min，12000 r，取上清用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)總量，操作步驟按說明書進行。各組均取等量的蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE凝膠電泳，凝膠轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。取該膜行免疫印跡染色，檢測相關(guān)蛋白表達?？贵w為:GFAP，Nestin，Gal C(Galactocerebroside)，and NeuN。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的獲得及鑒定:從骨髓中分離獲得的單個核細胞，在L-DMEM培養(yǎng)液(DMEM，10%FBS，1×青霉素-鏈霉素)中培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)。24 h時，大部分細胞均已貼壁，細胞呈圓形，顆粒狀。7 d時，部分細胞形態(tài)由顆粒狀開始變成梭形;14 d時呈典型的骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)，細胞呈長梭形，并漸呈漩渦狀聚集，呈簇狀生長(圖1)。當細胞增殖至80% ～90%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，培養(yǎng)液終止消化，無菌吸管沖洗貼壁的骨髓間充質(zhì)干細胞，獲得的細胞懸液按1∶2傳代，傳代細胞用于誘導(dǎo)分化。

2.2 流式細胞術(shù)鑒定獲得細胞為BMSCs:傳代4代骨髓間充質(zhì)干細胞，待細胞長到近90%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化3～5 min，制成單細胞懸液并計數(shù)，取1×106個細胞，用流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞表面抗原(abcam公司)CD105-PE(Serotec公司)，及造血干細胞的特異性標記物CD45-FITC(BD公司)、CD34-FITC(BD公司)的表達情況。結(jié)果顯示99.8%的細胞呈CD105陽性。CD45，CD34，和CD14等抗體呈陰性，提示從骨髓中分離獲得的細胞中幾乎全部為骨髓間充質(zhì)細胞。

2.3 免疫熒光染色技術(shù)鑒定分化細胞為神經(jīng)元或神經(jīng)元樣細胞:傳代后的BMSCs，經(jīng)EGF和HGF誘導(dǎo)2周后，取單孔培養(yǎng)皿，行免疫熒光染色并在熒光顯微鏡觀察。染色結(jié)果顯示:分化細胞中，A組和B組GFAP(神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白)呈弱陽性或陽性表達，但C組(對照組)呈陰性表達;A組和B組均有NeuN陽性表達，C組仍呈陰性表達(見圖2)。提示誘導(dǎo)分化的BMSCs已向神經(jīng)元樣細胞分化。

2.4 Western Blotting技術(shù)檢測分化細胞內(nèi)神經(jīng)元標志性蛋白表達情況:各組分化細胞經(jīng)胰酶消化后，Western Blotting檢測結(jié)果顯示，各組均有Nestin表達;A組及B組均有GFAP、Gal C及NeuN表達，但C組未見相關(guān)蛋白表達，且B組NeuN表達量明顯高于A組(圖3)。

圖1 骨髓基質(zhì)干細胞培養(yǎng)

3 討論

神經(jīng)元是神經(jīng)組織中的主要細胞，是一種高度分化的成體細胞，不可再分裂，損傷后較難恢復(fù)，故此神經(jīng)系統(tǒng)損傷是臨床疾病中較難治療的病癥之一。由于成體神經(jīng)元的不可再生性，目前臨床針對此類疾病的治療多以功能鍛煉以促進患者的恢復(fù)。亦有學(xué)者嘗試向患者的損傷部位內(nèi)移植神經(jīng)干細胞或胚胎干細胞，及改善受損部位神經(jīng)元周圍微環(huán)境，以誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞或胚胎干細胞分化，進行替代性治療［10-12］。但由于胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞需從胚胎或者成年腦組織中獲得的干細胞，受法律及倫理限制，相對較難獲得。BMSCs作為一種骨髓來源的多能干細胞，即可以誘導(dǎo)向神經(jīng)元樣細胞分化，又較易獲得，且可以直接從患者自身獲得，體外誘導(dǎo)后回輸患者，避免了不必要的機體排斥，是一種較為理想的治療性細胞。

圖2 免疫熒光染色結(jié)果(×400)

圖3 Western Blotting技術(shù)檢測結(jié)果

目前關(guān)于體外誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元分化的報道較多，多為加入不同的可誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元樣分化的生長因子，嘗試誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化。常見的誘導(dǎo)用生長因子有VEGF，EGF和BDNF等。本實驗擬嘗試驗證其中一種可誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的生長因子，HGF，是否可以誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化。實驗結(jié)果顯示:我們從骨髓中獲得的大量細胞基本上均為BMSCs(圖1);當加入誘導(dǎo)因子后(HGF或HGF聯(lián)合EGF)，分化細胞有突起生出，且表達相關(guān)的神經(jīng)元標志物 NeuN(圖2，圖3)，提示 HGF或HGF聯(lián)合EGF均可誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化，尤其是HGF聯(lián)合EGF誘導(dǎo)效果較為顯著。其機制為:①可能與EGF可促進干細胞類細胞增殖有關(guān)，因為以往的研究已發(fā)現(xiàn)BMSCs可表達 EGF 受體［6，13］;②HGF(肝細胞生長因子)具有多種功能，并在不同上皮細胞的器官發(fā)生中扮演著重要的角色，包括腎、肺、胃、腸黏膜、角膜以及皮膚表皮和皮下組織的再生［14-15］。同時在基質(zhì)細胞，如成骨細胞和成肌細胞的生長與分化中也扮演著重要的角色［14］。且HGF是一種腦組均表達的稀少神經(jīng)營養(yǎng)因子，可促進海馬和中腦內(nèi)神經(jīng)元的存活能力，并且可誘導(dǎo)新皮層中移植體突起的生長［16］。具體機制還有待于進一步研究。

［1］ Friedenstein AJ.Precuursor cells of mechanocytes［J］.Int Rev Cytol，1976，47:327.

［2］ 周 華，王 默，金 星，等.骨髓間質(zhì)干細胞聯(lián)合肝細胞生長因子基因治療兔肢體缺血［J］.中國普通外科雜志，2011，20(12):1342.

［3］ Pittenger F，Mackay A，Beek S，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］.Science，1999;284(5411):143.

［4］ Bianco P，Robey PG.Marrow Stromal cells［J］.J Clin Invest，2000，105(12):1663.

［5］ Woodburg D，Schwarz E J，Prockp D J，et al.Adult rat human bone marrow stromal cells differentiate into neurons［J］.J Neurosci Res，2000，61(4):364.

［6］ 楊宇輝，吳繼雄.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮祖細胞的分離培養(yǎng)及鑒定［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13(40):7886.

［7］ 胡 亮，董雅娟，柏學(xué)進，等.骨髓間充質(zhì)干細胞的研究進展［J］.萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2005，22(1):56.

［8］ Nakamura T，Nishizawa T，Hagiya M，Seki T，Shimonishi M，Sugimura A，et al.Molecular cloning and expression of human hepatocyte growth factor［J］.Nature，1989，342(6248):440.

［9］ Katz AJ，Tholpady A，Tholpady SS，Shang H，Ogle RC.Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal(hADAS)cells［J］.Stem Cells，2005，23(3):412.

［10］ 王志偉，馬秀現(xiàn)，李天曉，等.bFGF聯(lián)合骨髓干細胞動員劑促進兔缺血后肢血管新生的研究［J］.中國普通外科雜志，2007，16(2):136.

［11］ 楊繼武，劉偉平，周業(yè)庭，等.rhG-HGF聯(lián)合成纖維細胞生長因子促進下肢血管新生的實驗研究［J］.中國普通外科雜志，2009，18(6):584.

［12］ Cai L，Johnstone BH，Cook TG，et al.Suppression of hepatocyte growth factor production impairs the ability of adipose-derived stem cells to promote ischemic tissue revascularization［J］.Stem Cells，2007，25(12):3234.

［13］ 呂曉霞，尹 至，金 星，等.自體骨髓干細胞移植治療下肢缺血性疾病60例［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12(29):5653.

［14］ Wang PP，Xie DY，Liang XJ，et al.HGF and direct mesenchymal stem cells contact synergize to inhibit hepatic stellate cells activation through TLR4/NF-kB pathway［J］.PLoS One，2012，7(8):e43408.

［15］ Ikegame Y，Yamashita K，Hayashi S，et al.Comparison of mesenchymal stem cells from adipose tissue and bone marrow for ischemic stroke therapy［J］.Cytotherapy.2011，13(6):675.

［16］ Kachgal S，Putnam AJ.Mesenchymal stem cells from adipose and bone marrow promote angiogenesis via distinct cytokine and protease expression mechanisms［J］.Angiogenesis，2011，14(1):47.