李慧 趙璨 張華 張曉光 歐陽溪 馮美江

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種以黑質致密部多巴胺能神經(jīng)元減少為主要病理特征的慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前臨床上主要通過藥物或手術控制癥狀，但并不能阻斷PD的病理生理進程，所以仍需尋找針對PD病因的治療方法［1-2］。近年來研究證實，臍帶間充質干細胞(MSCs)能被誘導分化為多巴胺(DA)能神經(jīng)元，移植入PD模型鼠后癥狀改善，且中腦酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)表達量增加，因此可以作為PD的理想治療方案。此外，越來越多的研究表明，分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可能是干細胞發(fā)揮作用的機制之一［3-4］。本研究嘗試將人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)誘導分化為多巴胺能神經(jīng)元(dopam-inergic neurons)并對其鑒定，進一步觀察細胞中BDNF的表達情況。

1 材料和方法

1.1 材料 熒光二抗(購自武漢博士德公司)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、音猥因子 (SHH)、成纖維細胞生長因子8(FGF8)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)(購自RD公司)，Tryple酶和N2因子(購自GIBCO公司)，維生素C(Vit-C)和抗-TH抗體(購自美國Sigma公司)，抗-BDNF抗體和抗-β-微管蛋白Ⅲ抗體(購自 abcam公司)，抗-神經(jīng)元核抗原(NeuN)抗體(購自北京中杉金橋公司)，DAPI(購自碧云天公司)，倒置熒光顯微鏡(為Olympus公司產(chǎn)品)。

1.2 方法

1.2.1 臍帶MSCs的分離培養(yǎng):本實驗遵照倫理學標準及國家有關規(guī)范。在無菌條件下收集足月產(chǎn)健康新生兒臍帶，用生理鹽水充分沖洗并剔除臍動、靜脈，剝離出華通氏膠后將其剪碎至1 mm3大小，接種于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，置37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱內培養(yǎng)。16 d時用Tryple酶消化，見胞質回縮時加入DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)終止消化，將細胞懸液放入離心管內，800 r/min離心8 min，生理鹽水洗滌2次，原代以1∶2的比例進行再次接種培養(yǎng)，記為P1代。P2代以后按1∶2或1∶3的比例傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.2.2 誘導分化為多巴胺能神經(jīng)元:將P3代臍帶MSCs以1×104個/孔密度接種24孔細胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后更換神經(jīng)誘導液［DMEM/F12、50 μg/ml Vitc、250 ng/ml SHH、100 ng/ml FGF8、50 ng/ml bFGF、N2(100×)］。誘導9 d后，再往誘導液中加入50 ng/ml的BDNF(加入BDNF時，24孔板中的誘導液不換)，繼續(xù)誘導3 d，每天觀察，拍照，未誘導的臍帶MSCs作為對照。

1.2.3 誘導后細胞凍存、復蘇與存活率檢測:凍存時，采集誘導后細胞加入含10%二甲基亞砜(DMSO)的細胞凍存液，混勻后轉入凍存管，放入4℃預冷程序降溫盒，-80℃冰箱過夜后轉入液氮中保存。復蘇時，取出細胞凍存管立即放入37℃水浴箱，輕度搖動令其快速融化，將融化的細胞懸液轉入含生理鹽水的離心管中，離心去上清。取部分復蘇細胞檢測存活率:將細胞與臺盼藍混勻，計算細胞存活率(%)=活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)＋死細胞總數(shù))×100%。

1.2.4 免疫熒光檢測β-微管蛋白Ⅲ、NeuN、TH、BDNF蛋白表達:將P3代臍帶MSCs以8×103/cm2的密度接種入鋪有蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)24 h。采用上述神經(jīng)誘導液誘導12 d后開始進行免疫熒光染色鑒定;已誘導的凍存細胞經(jīng)復蘇后，在鋪有蓋玻片的6孔板中貼壁生長后即可進行免疫熒光檢測。4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗3次，每次3 min。加入含有0.1%TritonX-100的山羊血清室溫孵育30 min后，分別與β-微管蛋白Ⅲ抗體(稀釋濃度為1∶500)/TH(1∶1000)/NeuN(1∶100)/BDNF(1∶1500)孵育過夜;行熒光雙標時與一抗混合液孵育過夜:鼠抗-TH和兔抗-BDNF/兔抗-TH和鼠抗β-微管蛋白Ⅲ;加入 DAPI(稀釋濃度為1∶500)及相應二抗孵育120 min。熒光倒置顯微鏡觀察。隨機抽取3個視野進行細胞陽性率計數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計學分析:采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以±s表示，各實驗組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臍帶MSCs誘導前后形態(tài)學觀察 傳代培養(yǎng)2～3代后，可見細胞形態(tài)較為一致，為細長梭形細胞，呈克隆樣生長。見圖1。

2.2 UCMSCs誘導后分化為多巴胺能樣神經(jīng)元

2.2.1 細胞形態(tài)觀察:經(jīng)誘導分化后可見細胞胞體變大，逐漸伸出突起并伸長，表現(xiàn)出神經(jīng)細胞樣形態(tài)。見圖1。

圖1 臍帶MSCs誘導前后形態(tài)學觀察(×200)

2.2.2 免疫熒光鑒定神經(jīng)細胞標記蛋白:對照組免疫熒光檢測結果表明，未誘導的MSCs可表達β-微管蛋白Ⅲ，陽性率為(21.24±0.97)%，但NeuN、TH和BDNF均無表達。誘導組免疫熒光檢測DA能神經(jīng)元的特異性標志，TH陽性細胞表達率為(17.65±1.91)%;神經(jīng)元標記物β-微管蛋白Ⅲ及NeuN陽性細胞比率分別為(55.54±11.67)%和(70.00±7.52)%，均較對照組明顯升高(P＜0.05)。用免疫熒光分別檢測2組細胞內BDNF表達情況，對照組中無BDNF表達，而誘導組細胞中可見BDNF表達，陽性細胞比率為(14.15±3.04)%。復蘇后的誘導細胞仍可穩(wěn)定檢測到β-微管蛋白Ⅲ、TH和NeuN的表達(圖 2，3)。

2.2.3 已誘導細胞復蘇后細胞存活率檢測:細胞存活率為(92.5±1.83)%，復蘇后狀態(tài)良好，可在培養(yǎng)劑中正常生長。

3 討論

PD患病率在＞60歲老年人神經(jīng)退行性疾病中位居第二，僅次于阿爾茨海默病，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌肉強直、運動遲緩、步態(tài)異常。中腦黑質DA能神經(jīng)元的進行性變性、缺失和死亡是PD的主要病理改變。但是，目前的常規(guī)治療(包括內科及外科治療)僅能控制癥狀，并不能延緩、阻止PD病理的進展［1-2］。所以尋找針對PD的病因治療手段已成為當前該領域臨床研究的重點與難點。

干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，能在體內存活，分泌細胞因子，并替代死亡或者衰老的細胞。此外，干細胞源性DA能神經(jīng)元行移植治療還可補充腦內TH的不足，促進腦內DA的合成，因此，目前認為PD是最適合進行細胞替代治療(cell replacement therapy，CRT)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］。目前認為，多種類型的干細胞都可向DA能神經(jīng)元誘導分化，但臍帶MSCs有明顯的優(yōu)越性，其來源廣泛、易培養(yǎng)、免疫源性小、無倫理道德爭議及移植后能夠長期存活，從而決定其可作為一種優(yōu)秀的種子細胞［6］。

本實驗采用臍帶MSCs行兩步誘導法，首先應用SHH、FGF8、bFGF等特定細胞因子使其誘導分化形成成熟的神經(jīng)元，分化比例約為70%，并可明顯表達β-微管蛋白Ⅲ及NeuN等神經(jīng)元特異性標志物;再應用BDNF使其定向誘導分化形成多DA神經(jīng)元，比例約為17.65%，并可明顯表達特異性TH，誘導效率良好。誘導細胞可通過低溫保存，復蘇后細胞存活率高達(92.5±1.83)%，且能夠穩(wěn)定表達TH、β-微管蛋白 Ⅲ和NeuN。

本實驗檢測了誘導前后細胞中BDNF的表達，發(fā)現(xiàn)誘導前無BDNF表達，而誘導后細胞中可見明顯BDNF表達，且BDNF與TH共定位。大量研究表明，BDNF對DA能神經(jīng)元有營養(yǎng)、促分化和保護作用，應用反義核酸阻斷BDNF表達可導致黑質內DA能神經(jīng)元缺失［7-8］，提示 BDNF可能與 PD的發(fā)生和發(fā)展有關。同時有實驗證明，在PD模型鼠黑質內行人MSCs移植治療后，腦內BDNF含量明顯增高［9］。另外，在其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞替代治療研究中發(fā)現(xiàn)BDNF與干細胞移植聯(lián)合治療效果優(yōu)于單純干細胞移植治療［10］。目前普遍認同膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)在干細胞治療PD時發(fā)揮了一定的作用，而近期的研究表明，在PD小鼠模型中，GDNF對DA能神經(jīng)元的保護作用可能是通過上調Pitx3介導的細胞內BDNF合成而實現(xiàn)的［11］。上述研究均提示，BDNF能提高干細胞移植的療效并且可能是該療法的作用機制之一。我們對比了誘導前后細胞內BDNF的表達，HUCMSCs無表達，而誘導后細胞表達比率為(14.15±3.04)%。該結果提示，誘導后含部分DA能神經(jīng)元的細胞可能較HUCMSCs更適合PD的細胞替代治療。

綜上所述，臍帶MSCs經(jīng)特定的誘導劑作用后可部分定向分化為PA能神經(jīng)元，此類DA能神經(jīng)元內不僅能有效表達TH，還可表達BDNF，因此不僅有可能補充腦內DA的生成不足，還可能發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)與保護作用。我們的研究結果可能為今后應用此類細胞進行PD的細胞替代治療提供一定的理論基礎。然而，PD細胞替代治療的療效不僅取決于干細胞供體，可能還與其體內存活率、分化潛能以及微環(huán)境與干細胞的相互影響等因素有關。所以，仍需在今后的在體實驗中進一步觀察，以明確此類來源于HUCMSCs的DA能神經(jīng)元在PD細胞替代治療中的真正作用。

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