趙付菊，劉華勇，周麗芳，方 毅，龐立峰，劉文健，趙 虎

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040;2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032)

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種非發(fā)酵的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界和醫(yī)院環(huán)境中，是導(dǎo)致醫(yī)院感染最常見(jiàn)的條件致病菌之一[1]，可引發(fā)呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、導(dǎo)管相關(guān)性血流感染、繼發(fā)性腦膜炎、泌尿道感染及傷口感染等，其中以重癥監(jiān)護(hù)室患者感染發(fā)生率最高[2]。近年來(lái)，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類及廣譜β-內(nèi)酰胺類等抗菌藥物產(chǎn)生多藥耐藥的現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，尤其是泛耐藥菌株的產(chǎn)生，使得臨床抗感染治療面臨極大的挑戰(zhàn)[1，3]。因此，了解鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥變化情況，避免感染相關(guān)的高危因素，合理選擇現(xiàn)有的抗菌藥物對(duì)預(yù)防和控制多重耐藥和泛耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株產(chǎn)生和傳播至關(guān)重要。為此，我們收集分離自住院患者的138株鮑曼不動(dòng)桿菌，其中有10例感染泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(PDRAB)，對(duì)PDRAB的耐藥性、感染患者的病史特點(diǎn)及治療情況進(jìn)行了分析。

材料和方法

一、菌株來(lái)源及研究對(duì)象

收集復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院2011年9月1日至2012年7月31日分離自住院患者的鮑曼不動(dòng)桿菌138株，其中PDRAB 11株。11株菌株中包括同一患者來(lái)源但不同時(shí)期分離的2株P(guān)DRAB，對(duì)感染PDRAB的10例臨床病例進(jìn)行回顧性調(diào)查。

二、細(xì)菌分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)

細(xì)菌分離培養(yǎng)按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)方法進(jìn)行。菌株進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn)采用法國(guó)生物梅里埃公司VITEK-2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌分析儀，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2012指導(dǎo)原則判讀細(xì)菌耐藥性。質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供。藥敏紙片頭孢曲松、頭孢西丁、多黏菌素B紙片購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。

三、微量板半定量法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成

微量板半定量法參照Tomaras等[4]的實(shí)驗(yàn)方法。96孔板購(gòu)自Grenier公司，結(jié)晶紫購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。挑取平皿上單個(gè)菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h(108 CFU/mL)，用含0.25%葡萄糖的LB培養(yǎng)基1∶200稀釋后加入96孔培養(yǎng)板(200 μL/孔，3復(fù)孔)，37℃靜置培養(yǎng)24 h，棄菌液，PBS重復(fù)洗滌3次，后用99%甲醇固定15 min，棄甲醇室溫干燥，加入2% 結(jié)晶紫染色8 min，水洗至無(wú)色，室溫干燥后，每孔200 μL 95%乙醇脫色5 min，所得有色溶液用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm吸光度(A)值。以A值的平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差(s)作為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)生物膜形成的能力。試驗(yàn)重復(fù)3次。強(qiáng)陽(yáng)性:A值≥2.0，中等陽(yáng)性:1.0 ＜A 值 ＜1.9，陰性:A 值≤0.9。

四、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)進(jìn)行鮑曼不動(dòng)桿菌同源性分析

配制細(xì)胞懸浮液[100 mmol/L Tris∶100 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)1∶1，pH 值 8.0]，用滅菌棉簽挑取平板上的細(xì)菌制成均勻的細(xì)菌懸液，調(diào)整細(xì)菌懸液的濃度到4麥?zhǔn)蠁挝?。?00 μL細(xì)菌懸液和10 μL 20 mg/mL蛋白酶K混合，取50℃水浴中的1%Seaken Gold瓊脂糖凝膠200 μL混勻制成膠塊。膠塊凝固后將其置于5 mL的細(xì)胞裂解液與25 μL 20 mg/mL蛋白酶 K混合液中，50℃輕振蕩3 h。用水洗膠2次，TE緩沖液洗4次。最后將膠塊置5 mL TE緩沖液中，4℃保存。切2 mm寬的膠塊置于含30 μL ApaⅠ酶的酶切緩沖體系中，37℃酶切3 h。配制1%Seaken Gold瓊脂糖凝膠160 mL，置于54℃水浴中，將酶切后的膠塊按序排列在樣品梳對(duì)應(yīng)位置，將瓊脂糖緩慢倒入模具中，凝固后，拔出樣品梳，將膠塊置入電泳槽中。電泳條件:電壓6 V/cm，電泳時(shí)間 16 h，脈沖參數(shù) 0.22 ～18 S、120°，電泳溫度14℃。電泳結(jié)束后，Gelred染色，用熒光成像儀讀膠分析。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用WHONET 5軟件和SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。抗菌藥物種類與療效的相關(guān)性分析采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn);用四格表資料Fisher精確概率法對(duì)菌株生物膜形成陽(yáng)性率進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PDRAB感染患者的臨床特點(diǎn)

10例患者中呼吸重癥監(jiān)護(hù)室(RICU)7例、普外科2例、重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)1例。檢出標(biāo)本以痰標(biāo)本為主，共8例，膽汁標(biāo)本1例，中心靜脈導(dǎo)管標(biāo)本1例。主要病癥為惡性腫瘤、肺炎?；颊咧饕獮楦啐g患者，平均年齡為85歲。發(fā)生PDRAB感染前平均住院天數(shù)178 d，抗菌藥物治療后6例好轉(zhuǎn)，3例死亡，1例治愈，見(jiàn)表1。

表1 10例感染PDRAB的患者的臨床資料信息

二、感染患者的高危因素分析

10例患者均有慢性病史，合并3種及以上疾病的患者有7例(70%)。均采用機(jī)械通氣、靜脈置管(占100%);采用引流管9例(90%);手術(shù)6例(60%)。10例患者在感染PDRAB前均有抗菌藥物使用史(100%)。PDRAB感染主要發(fā)生于長(zhǎng)期住院的高齡危重病患者，多合并糖尿病及心腦血管疾病，有機(jī)械通氣、導(dǎo)管留置、手術(shù)及抗菌藥物治療史，采用多種藥物聯(lián)合治療效果好。

三、患者感染PDRAB前30 d內(nèi)抗菌藥物應(yīng)用情況

10例患者在發(fā)生PDRAB感染前均已接受過(guò)抗菌藥物治療，以應(yīng)用碳青霉烯類和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物為主，分別為9例和6例，平均使用天數(shù)分別為15.7 d和14.3 d;其次為3代以上頭孢類和抗真菌類，均為5例，平均使用天數(shù)均較長(zhǎng)，分別為17.8 d和21.8 d;應(yīng)用喹諾酮類為4例，平均使用天數(shù)為12.25 d。

四、患者感染PDRAB后抗菌藥物使用情況及療效和轉(zhuǎn)歸

10例感染PDRAB患者經(jīng)治療后總有效(治愈+好轉(zhuǎn))率為60%，1例病情無(wú)明顯變化，使用一種藥物治療6 d后出院，3例惡化，均因感染加重原發(fā)病而死亡。抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用種類數(shù)目，好轉(zhuǎn)組平均為5.5種，平均使用天數(shù)19.2 d;惡化組平均為3.7種，平均使用天數(shù)為9.1 d。

五、藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

10株P(guān)DRAB對(duì)目前所有常規(guī)抗菌藥物耐藥率為100%，對(duì)多黏菌素B敏感率為100%。

六、微量板半定量法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜形成情況

138株鮑曼不動(dòng)桿菌中有7例生物膜形成能力檢測(cè)陽(yáng)性，檢出率為 5.07%;其中 2株為PDRAB菌株、5株為非PDRAB菌株。PDRAB生物膜檢出率為20%，非PDRAB生物膜檢出率為3.9%。2株P(guān)DRAB與5非PDRAB的耐藥性比較見(jiàn)表 2、3。

表2 微量板半定量法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜形成情況 [株(%)]

表3 2株生物膜陽(yáng)性PDRAB與其他5株生物膜陽(yáng)性非PDRAB對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥性比較

七、脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果

對(duì)9例感染PDRAB的患者分離的10株(包括來(lái)源同一患者不同時(shí)期的2株P(guān)DRAB)和1株非PDRAB(2012年2月6日分離自RICU)進(jìn)行PFGE分析，共檢出7種類型，A、D、E型各有2例;B、C、F、G 型各有1例。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 PDRAB PFGE圖譜

圖2 PDRAB PFGE結(jié)果的樹(shù)狀圖

討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌作為一種條件致病菌，可定植于人體皮膚、傷口、呼吸道和胃腸道，對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)力極強(qiáng)，能在醫(yī)院干燥物體表面長(zhǎng)期存活。多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌已經(jīng)在全球各地廣泛流行，甚至造成醫(yī)院感染的爆發(fā)流行[5]，且耐藥率仍不斷增加[6]，有關(guān)世界各地的泛耐藥菌株感染的報(bào)道也頻頻出現(xiàn)[1]。復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院2011年9月～2012年7月期間PDRAB占該菌總株數(shù)率為7.97%，與孫樹(shù)梅等[7]報(bào)道基本一致。PDRAB菌株主要來(lái)自痰標(biāo)本，分布科室以RICU為主。10例病例中90%為70歲以上的高齡患者，以晚期腫瘤患者及反復(fù)發(fā)生吸入性肺炎的長(zhǎng)期臥床患者為主，同時(shí)多合并糖尿病及其他慢性呼吸系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)疾病;90%以上的患者在感染泛耐藥菌株前接受過(guò)呼吸機(jī)輔助通氣、導(dǎo)管留置和多種抗菌藥物的治療，其中碳青霉烯類使用率最高，與 Manikal等[8]的研究一致。

鮑曼不動(dòng)桿菌可以通過(guò)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、改變細(xì)胞膜的通透性、主動(dòng)外排泵、改變藥物作用靶點(diǎn)和形成生物膜等機(jī)制對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥[1，9-12]。某些能形成生物膜的鮑曼不動(dòng)桿菌，更易在醫(yī)院環(huán)境中長(zhǎng)期存活[13]，臨床危害更大。本研究138株鮑曼不動(dòng)桿菌中生物膜陽(yáng)性7株，其中PDRAB菌株2株、非PDRAB菌株5株，對(duì)這2組生物膜陽(yáng)性的菌株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.082)，得出生物膜與菌株的耐藥可能為2個(gè)獨(dú)立的耐藥機(jī)制。2株生物膜陽(yáng)性的PDRAB菌株來(lái)自RICU，必須采取包括隔離患者、專人護(hù)理、對(duì)患者盡量使用專用的醫(yī)療設(shè)備和物品的綜合性感染防控措施。對(duì)5株生物膜陽(yáng)性的非泛耐藥菌株所在的病區(qū)也應(yīng)采取適當(dāng)防控措施，從而避免新的泛耐藥且生物膜陽(yáng)性的菌株出現(xiàn)和傳播。

臨床分離的耐藥菌株的分子流行病學(xué)調(diào)查對(duì)分析菌株間相關(guān)性，追蹤傳染源和傳播途徑，有效控制醫(yī)院感染意義重大。PFGE具有分辨率高、重復(fù)性好、分型力強(qiáng)的特點(diǎn)，為細(xì)菌同源性分析的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究10株P(guān)DRAB菌株分7種類型，2011年9～12月分離的4例PDRAB菌株中分為D和E型，均分離自同一病區(qū)且體外藥敏試驗(yàn)完全一致，提示此期間有發(fā)生交叉感染的可能;2012年1～7月檢出的PDRAB菌株型無(wú)明顯同源性。值得注意的是，有2株P(guān)DRAB菌株來(lái)源同一患者不同時(shí)期(時(shí)間間隔17 d)，其同源性明顯不一致;其中1株具有生物膜形成能力，提示患者感染了新的泛耐藥菌株。因此，出現(xiàn)同一患者多次分離到PDRAB，不一定為定植菌，需要結(jié)合病情變化和治療效果及其他方法等排除感染新的泛耐藥菌的可能。PFGE結(jié)果顯示2011年9月8日分離自普外科的1株P(guān)DRAB菌株與2012年2月6日分離自RICU的非PDRAB同源性一致，但基于臨床沒(méi)有交叉感染的危險(xiǎn)因素存在，體外藥物敏感試驗(yàn)不一致，且PFGE得到的親緣關(guān)系并非真正意義上的種系發(fā)生情形[14]，故判定為兩菌株來(lái)源不同。建議在應(yīng)用PFGE分析同源性的同時(shí)還需結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果和其他分子分型資料才能最終確定疾病的傳染源。

鮑曼不動(dòng)桿菌在短短幾十年內(nèi)成為醫(yī)院感染的最重要病原菌之一，已成為我國(guó)重癥監(jiān)護(hù)病房檢出率最高的病原菌[15]。鮑曼不動(dòng)桿菌雖然致病力較弱，但耐藥性較強(qiáng)，尤其是對(duì)泛耐藥的菌株使臨床醫(yī)生陷入無(wú)藥可用的困境。因此，開(kāi)展研發(fā)新的抗菌藥物治療同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)，嚴(yán)格把握抗菌藥物治療指針，加強(qiáng)消毒隔離，從而有效控制預(yù)防耐藥菌株的爆發(fā)流行，改善耐藥現(xiàn)狀。

[1]Roca I，Espinal P，Vila-Farrés X，et al.The Acinetobacter baumannii oxymoron:commensal hospital dweller turned pan-drug-resistant menace[J].FrontMicrobiol，2012，3:1-148.

[2]Fournier PE，Richet H.The epidemiology and control of Acinetobacter baumannii in health care facilities[J].Clin Infect Dis，2006，42(5):692-699.

[3]Morgan DJ，Weisenberg SA，Augenbraun MH，et al.Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii in New York City-10 years into the epidemic[J].Infect Control Hosp Epidemiol，2009，30(2):196-197.

[4]Tomaras AP，Dorsey CW，Edelmann RE，et al.Attachment to and biofilm formation on abiotic surfaces by Acinetobacter baumannii:involvement of a novel chaperone-usher pili assembly system[J].Microbiology，2003，149(Pt 12):3473-3484.

[5]Vincent J，Rello J，Marshall J，et al.International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units[J].JAMA，2009，302(21):2323-2329.

[6]Le Hello S，F(xiàn)alcot V，Lacassin F，et al.Risk factors for carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii infections at a tertiary care hospital in New Caledonia，South Pacific[J].Scand J Infect Dis，2010，42(11-12):821-826.

[7]孫樹(shù)梅，王茵茵，姚翠軍，等.泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染的臨床特征及抗感染治療分析[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(10):2351-2353.

[8]Manikal VM，Landman D，Saurina G，et al.Endemic carbapenem-resistant Acinetobacter species in Brooklyn，New York:citywide prevalence，interinstitutional spread，and relation to antibiotic usage[J].Clin Infect Dis，2000，31(1):101-106.

[9]Munoz-Price LS，Weinstein RA.Acinetobacter infection[J].N Engl J Med，2008，358(12):1271-1281.

[10]杜 坤，應(yīng)春妹，汪雅萍，等.上海地區(qū)四家醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27(2):103-109.

[11]侯盼飛，杜 坤，應(yīng)春妹，等.亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵機(jī)制研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27(2):95-98.

[12]羅柳林，應(yīng)春妹，倪培華，等.耐碳青霉烯類抗菌藥物鮑曼不動(dòng)桿菌膜蛋白機(jī)制研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，25(4):304-308.

[13]Espinal P，Martí S，Vila J.Effect of biofilm formation on the survival of Acinetobacter baumannii on dry surfaces[J].J Hosp Infect，2012，80(1):56-60.

[14]王麗麗，徐建國(guó).脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)(PFGE)在分子分型中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].疾病監(jiān)測(cè)，2006，21(5):276-279.

[15]張 麗，楊文航，肖 盟，等.2010年度衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)報(bào)告:ICU來(lái)源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22(1):34-38.