鄢春亭 陳奕名 韓 笑 (吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 吉林 3202)

內(nèi)毒素休克所致的腎功能障礙是臨床常見的危重急癥，其中70%的病人需要腎臟替代治療，死亡率仍居高不下〔1〕。脂多糖內(nèi)毒素(LPS)可通過激活一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑，刺激機(jī)體免疫細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子及自由基，誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔2〕。此過程中，腎臟是受累的重要器官，單核細(xì)胞(CD14)即LPS受體是通常選擇的關(guān)鍵蛋白，在LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)擬探討CD14與白細(xì)胞介素-18(IL-18)在內(nèi)毒素休克大鼠腎組織中的變化以及人參二醇皂苷(PDS)對(duì)其影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PDS(吉林大學(xué)天然藥物研究室提供);大腸埃希桿菌內(nèi)毒素(LPS，E.Coli 0111:B4)，購于 Sigma公司;CD14多克隆抗體(BA0719)，IL-18多克隆抗體(BA1215)購于博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 30只成齡Wistar大鼠，吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物繁育中心提供。雌雄不拘，體重(250±10)g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(CTR)，LPS模型組(LPS)，人參二醇皂苷預(yù)防治療組(PDS)。

1.2.2 模型建立及組織留取 Wistar大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食過夜，自由攝水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥固定于鼠板上。手術(shù)分離一側(cè)股動(dòng)脈并插管，與壓力傳感器相連，記錄基礎(chǔ)血壓。舌下靜脈注射 LPS(5 mg/kg)，平均血壓下降至實(shí)驗(yàn)前基礎(chǔ)血壓的2/3時(shí)判定為休克狀態(tài)，記錄休克前后不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)脈血壓的動(dòng)態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)前CTR組和LPS組靜脈注射5%葡萄糖溶液(5 ml/kg);PDS組用人參二醇皂苷(20 mg/kg)，均以等容量的5%葡萄糖配制靜脈注射。10 min后除CTR組外，均經(jīng)舌下靜脈注射5%葡萄糖稀釋的LPS(5 mg/kg)，CTR組靜脈注射等容量的5%葡萄糖溶液。于休克240 min時(shí)處死動(dòng)物。取腎臟置液氮中速凍，后轉(zhuǎn)為－70℃保存，用于蛋白質(zhì)的研究。另取腎臟組織置10%中性甲醛中固定16 h，石蠟包埋，切片，用于形態(tài)學(xué)研究。

1.2.3 腎臟組織免疫組織化學(xué) 應(yīng)用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組織化學(xué)染色法，常規(guī)方法處理玻片后用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常兔血清滴于組織片上封閉非特異蛋白，加兔抗鼠CD14多克隆抗體(1∶500稀釋濃縮型抗體)，后滴加生物素化的兔抗鼠IgG，顯微鏡下觀察組織中CD14表達(dá)，照相。

1.2.4 CD14和IL-18蛋白表達(dá)

1.2.4.1 腎臟組織蛋白的提取 參照《分子克隆學(xué)》提供的方法提取腎組織總蛋白和膜蛋白，并以Bio-rad蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定提取蛋白的濃度。

1.2.4.2 Westren印跡 取蛋白15 μg，加蛋白上樣緩沖液，加10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉過夜。分別以CD14，IL-18進(jìn)行免疫印跡雜交(兔抗大鼠CD14多克隆一抗?jié)舛葹?∶500稀釋，兔抗大鼠IL-18多克隆一抗?jié)舛葹?∶300稀釋)，室溫與膜孵育120 min，洗膜后加入1∶2 000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗。室溫孵育60 min。然后溶于過硫酸銨(AP)緩沖液的堿性磷酸酶底物顯色試劑盒(NBT-BCIP)顯色液顯色。特異性條帶的光密度值采用上海天能科技有限公司GIS圖像分析系統(tǒng)處理。陰性對(duì)照膜用未免疫的兔血清1∶200稀釋，代替一抗，其他過程同上。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織CD14免疫組化結(jié)果 LPS組的腎臟組織CD14蛋白呈陽性表達(dá)，而PDS組CD14蛋白表達(dá)水平與LPS組相比明顯降低。見圖1。

2.2 腎臟組織CD14的表達(dá) Westem印跡掃描分析腎臟組織LPS組的腎臟組織CD14蛋白表達(dá)水平最高，而PDS組CD14蛋白表達(dá)水平與LPS組相比明顯降低。見圖2，表1。

圖1 CD14在內(nèi)毒素休克大鼠腎臟的表達(dá)(×40)

表1 各組腎臟組織中CD14和IL-18蛋白相對(duì)含量(±s，n=3)

表1 各組腎臟組織中CD14和IL-18蛋白相對(duì)含量(±s，n=3)

與CTP組比較:1)P＜0.05;與LPS組比較:2)P＜0.05

組別 CD14蛋白 IL-18蛋白CTR組0.280 5±0.003 7 0.207 7±0.006 2 LPS組 0.924 1±0.028 01) 4.142 4±0.051 81)PDS組 0.620 7±0.004 42) 1.319 0±0.010 92)

圖2 Western印跡分析各組腎臟中CD14的表達(dá)

2.3 腎臟組織IL-18蛋白的表達(dá) Westem印跡掃描分析腎臟組織，與CTR組相比，LPS組IL-18蛋白表達(dá)水平明顯增高;與LPS組相比，PDS組IL-18蛋白表達(dá)水平明顯減少。見表1，圖3。

圖3 Western印跡分析各組腎臟中IL-18的表達(dá)

3 討論

內(nèi)毒素休克以全身性低血壓和多臟器衰竭為主要臨床特征，導(dǎo)致的腎功能障礙是臨床常見的危重急癥。全身炎癥反應(yīng)綜合征是引起多器官功能障礙的重要原因，而炎細(xì)胞的持續(xù)活化與播散，活化炎細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)的失去自限性，通過自我無限放大的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，炎癥介質(zhì)過多產(chǎn)生與釋放，引起細(xì)胞乃至臟器損傷，嚴(yán)重者導(dǎo)致多臟器衰竭，成為內(nèi)毒素休克死亡的重要原因。目前研究已經(jīng)證明，LPS受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活是導(dǎo)致炎癥細(xì)胞活化及促炎因子大量釋放的關(guān)鍵。LPS首先與LPS的結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合，再傳遞給膜受體CD14，形成LPS-LBP-CD14復(fù)合物〔3〕，該復(fù)合物與跨膜受體TLR-MD2相互作用，通過激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路而最終導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)活化入核，引起多種炎癥因子(TNF-α，IL-6，IL-18等)的合成與釋放〔4～6〕。

腎小球系膜細(xì)胞(MCs)是腎小球內(nèi)非?；钴S的固有細(xì)胞，在內(nèi)毒素休克腎臟損傷中既是靶細(xì)胞，又是參與者。腎小管上皮細(xì)胞(TECs)是腎臟的另一重要細(xì)胞，具有抗原遞呈功能，并可通過自分泌和旁分泌方式分泌多種炎癥因子參與腎小管的炎癥形成〔7〕。研究表明，MCs表面可表達(dá)膜 CD14分子(mCD14)。mCD14在人類和多種動(dòng)物的單核細(xì)胞上大量表達(dá)，粒細(xì)胞上少量表達(dá)，在多數(shù)組織巨噬細(xì)胞也有表達(dá)，它們統(tǒng)稱為CD14陽性細(xì)胞。典型的CD14陽性細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)模式為:LPS先與LBP形成復(fù)合物，再與mCD14結(jié)合，然后引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞效應(yīng)的產(chǎn)生〔8，9〕。而 TECs不能表達(dá)mCD14，可由LPS直接刺激，與sCD14結(jié)合，產(chǎn)生活性氧自由基及炎癥細(xì)胞因子。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS組大鼠腎臟組織CD14，IL-18蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，而PDS組能顯著降低其表達(dá)。由此可見，PDS可阻斷LPS與受體結(jié)合向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，從而在LPS信號(hào)傳導(dǎo)通路的上游發(fā)揮作用，避免了繼續(xù)的過度反應(yīng)，減少了NF-κB的入核，使各種炎癥因子的表達(dá)量減少。

PDS為人參總甙中水溶性部分，是人參重要活性成分，有廣泛的藥理作用。本研究室對(duì)PDS從事多年研究表明，PDS具有降血脂、抗血小板聚積、抗心肌缺血、提高身體免疫力、預(yù)防感染等作用，PDS對(duì)內(nèi)毒素休克大鼠肝臟及肺臟有明顯的保護(hù)作用〔10，11〕。本研究結(jié)果表明:PDS抑制CD14的表達(dá)，從而抑制IL-18等炎癥因子的釋放，是實(shí)現(xiàn)對(duì)腎臟保護(hù)作用的重要機(jī)制。

1 Bagshaw SM，George C，Bellomo R.Changes in the incidence and outcome for early acute kidney injury in a cohort of Australian intensive care units〔J〕.Crit Care，2007;11(3):R68.

2 Watters JM，Tieu BH，Todd SR，et al.Fluid resuscitation increases inflammatory gene transcription after traumatic injury〔J〕.J Trauma，2006;61(2):300-8.

3 Cowan DB，Poutias DN，Del Nido PJ，et al.CD14-independent activation of cardiomyocyte signal transduction by bacterial endotoxin〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000;279(2):H619-29.

4 Chandrasekar B，Valente AJ，F(xiàn)reeman GL，et al.Interleukin-18 induces human cardiac endothelial cell death via a novel signaling pathway involving NF-kappaB-dependent PTEN activation〔J〕.Bioch Bioph Res Commun，2006;339(3):956-63.

5 付金鵬，尤勝義.IL-18與膿毒癥免疫功能紊亂〔J〕.國際外科學(xué)雜志，2007;34(8):550-2.

6 Orange JS，Geha RS.Finding NEMO:genetic disorders of NF-κB activation〔J〕.J Clin Invest，2003;112(7):983-5.

7 Tetta C，Cavaillon JM，Camussi G，et al.Continuous plasma filtration coupled with sorbents〔J〕.Kidney Int，1998;53(suppl 66):186-9.

8 Fanous MY，Phillips AJ，Windsor JA.Mesenteric lymph:the bridge to future management of critical illness〔J〕.J Pancreas，2007;8(4):374-99.

9 Kim JI，Lee CJ，Jin MS，et al.Crystal structure of CD14 and its implications for lipopolysaccharide signaling〔J〕.J Biol Chem，2005;280(12):11347-51.

10 于振香，彭麗萍，左夢(mèng)華，等.人參二醇皂甙對(duì)“兩次打擊”全身炎癥反應(yīng)綜合征大鼠肺CD14和NF-kB表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2007;27(3):208-10.

11 李 璐，劉喜春，于振香，等.人參二醇皂甙對(duì)內(nèi)毒素休克大鼠肺CD14和NF-kB表達(dá)的影響〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2005;31(2):231-5.