楊雁鴻 周文文 唐利娟 齊曦明 侯燕燕 才麗娜 潘福棟 彭 勇

(秦皇島市第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北 秦皇島 066000)

研究結(jié)果表明，內(nèi)在的遺傳因素在環(huán)境因素的聯(lián)合作用下影響肺癌的發(fā)生。維生素D受體(VDR)基因多態(tài)性與癌癥的發(fā)生有著密切聯(lián)系〔1〕。VDR是介導(dǎo)1，25(OH)2D3發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子，為類固醇激素、甲狀腺激素受體超家族成員。維生素D在正常肺組織內(nèi)的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞分化的作用，這種功能受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子——VDR的調(diào)節(jié)。1，25(OH)2D3活性維生素D在體內(nèi)具有多方面的活性，是維持鈣、磷平衡和骨代謝的主要激素之一。除此之外，1，25(OH)2D3在腫瘤的預(yù)防和治療方面也具有重要作用〔2～4〕。許多體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了1，25(OH)2D3對(duì)肺癌的抑制作用〔5〕。VDR與肺癌相關(guān)性的研究目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。檢測(cè)的VDR基因多態(tài)性酶切位點(diǎn)分別為Apa1、Bsm1、Fok1和Taq1。本文探索VDR基因多態(tài)性酶切位點(diǎn)Apa1、Bsm1和Taq1與吸煙因素的單獨(dú)作用及兩者間交互作用，對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)生的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2010年10月至2012年10月我院住院NSCLC患者144例為NSCLC組。其中鱗狀細(xì)胞癌66例、腺癌72例、腺鱗癌、大細(xì)胞癌及未分類癌共6例。其中男90例，女54例，年齡57～70歲，平均65.4歲，吸煙105例;對(duì)照組142例為健康體檢者，男92例，女50例，年齡55～74歲，平均66.0歲，吸煙71例。所有患者經(jīng)病理學(xué)確診為原發(fā)性肺癌，無(wú)肺癌家族史和職業(yè)致癌物接觸史。兩組年齡、性別構(gòu)成上均衡可比。根據(jù)Zhao等〔6〕研究將吸煙個(gè)體定義為吸煙或曾經(jīng)吸煙大于100支以上。

1.2 研究方法 外周血DNA分離試劑盒，TaqDNA聚合酶及其緩沖液，4dNTPs，Apa1、Bsm1和 Taq1限制性內(nèi)切酶，MarkerⅠDNA及l(fā)adder DL2000 Marker是Solarbio及天根生化科技有限公司產(chǎn)品。引物序列根據(jù)基因庫(kù)公布的VDR基因序列，并采用DNAman程序設(shè)計(jì)，由北京鼎國(guó)昌盛生物公司合成。根據(jù)酶切結(jié)果選取各個(gè)位點(diǎn)不同基因型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)，以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段并且確定基因型。

基因DNA取自外周血，采用外周血DNA分離試劑盒提取。Apa1位點(diǎn)PCR反應(yīng)體系總量為25 μl，Bsm1位點(diǎn)PCR反應(yīng)體系總量為 20 μl，Taq1 位點(diǎn) PCR 反應(yīng)體系總量為 25 μl，包含有基因組 DNA、引物 TaqDNA聚合酶緩沖液及0.5 μl的TaqDNA聚合酶。Apa1的上游引物為5'-AGGTCGGCTAGCTTCTGGATCATC-3'，下 游 引 物 為 5'-AGATCCTAAATGCACGGAGAAGTC-3'。Taq1的上游引物為5'-AGGTCGGCTAGCTTCTGGATCATC-3'，下 游 引 物 為 5'-AGATCCTAAATGCACGGAGAAGTC-3'。其反應(yīng)條件如下:預(yù)變性 95℃ 5 min，變性94℃ 30 s，退火52℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)。最后，一個(gè)循環(huán)為72℃10 min延伸。

Bsm1的上游引物5'-GGACCTGTGGCAACCAAGACT-3'，下游引物為5'-GCCCGCAAGAAACCTCAAATA-3'。通過(guò)編好程序的PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其循環(huán)條件如下:Bsm1位點(diǎn)PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 5 min，變性94℃ 30 s，退火57℃ 40 s，延伸72℃ 50 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)。最后，一個(gè)循環(huán)為72℃ 5 min延伸。各目的片段產(chǎn)物加入對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶5 μl及其緩沖液，其產(chǎn)物在65℃恒溫箱16 h，然后對(duì)酶切產(chǎn)物電泳。

1.3 結(jié)果判斷 目的片段產(chǎn)物經(jīng)Bsm1或Taq1酶切后電泳條帶可能出現(xiàn)3種情況:等位基因沒(méi)有酶切位點(diǎn)的純合子出現(xiàn)1個(gè)條帶，分別以兩個(gè)相應(yīng)內(nèi)切酶的第一個(gè)大寫(xiě)字母表示其基因型，即分別表示為AA、BB或TT，只有一個(gè)酶切位點(diǎn)的雜合子出現(xiàn)3個(gè)條帶，分別以相應(yīng)的大小寫(xiě)字母表示其基因型，即Aa、Bb或Tt;有兩個(gè)酶切位點(diǎn)的純合子出現(xiàn)2個(gè)條帶，分別表示為aa、bb 或 tt。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS9.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和非條件Logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 酶切后電泳結(jié)果 Apa1、Bsm1和Taq1的各基因型的條帶數(shù)目及位置見(jiàn)圖1。

2.2 VDR基因型分布 Bsm1位點(diǎn)兩組bb、Bb基因型頻率分布差異不顯著(P＞0.05)。兩組的b、B等位基因頻率無(wú)差異(P＞0.05)。Apa1位點(diǎn)，兩組aa、Aa、AA基因型頻率分布差異顯著(P=0.032)。以Aa+AA基因型做參照，攜帶aa基因型可增加吸煙人群NSCLC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。兩組的a、A等位基因頻率差異顯著(P=0.009)，且與攜帶等位基因A相比攜帶等位基因a的個(gè)體可增加吸煙人群NSCLC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Taq1位點(diǎn)，兩組tt、Ft、TT基因型頻率分布差異不顯著(P＞0.05)。兩組的t、T等位基因頻率差異不顯著(P=0.191)。見(jiàn)表2。

表1 兩組VDR的Apa1、Bsm1及Taq1基因多態(tài)性分布(n)

表2 兩組吸煙人群VDR基因3個(gè)位點(diǎn)基因型及等位基因的頻率分布〔n(%)〕

圖1 VDR-PCR產(chǎn)物經(jīng)Apa1、Bsm1和Taq1酶切后的電泳圖

3 討論

預(yù)計(jì)于2015年我國(guó)將成為全球肺癌發(fā)病率最高的國(guó)家〔7〕。雖然有研究顯示，年齡不是肺癌的獨(dú)立預(yù)后因素〔8〕，但由于老年人各臟器功能減退，治療并發(fā)癥的發(fā)生常使老年人不能順利完成治療或放棄治療，從而影響老年肺癌患者的生存期。多項(xiàng)研究表明肺癌的發(fā)生是由環(huán)境暴露和個(gè)體的遺傳因素的相互作用而導(dǎo)致的多因素多階段的惡性疾病。致癌物在不同個(gè)體的活性差異可以達(dá)數(shù)十倍，個(gè)體的遺傳因素是一個(gè)重要原因〔1〕。

1，25(OH)2D3通過(guò)VDR介導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，而VDR幾乎表達(dá)于所有的組織細(xì)胞。有資料表明，在肺癌細(xì)胞高表達(dá)的VDR與提高生存率有關(guān)〔9〕。有關(guān)肺癌組織和肺癌前病變VDR表達(dá)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，VDR在60%肺正常組織和61%肺化生組織中呈中-高度核表達(dá)。在肺癌組織中，VDR核表達(dá)為79%，62%的細(xì)胞質(zhì)缺乏表達(dá)〔10〕。另外，一項(xiàng)關(guān)于人類癌癥的初步研究，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)測(cè)量VDR的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)正常細(xì)胞發(fā)生惡變時(shí)，VDR的表達(dá)數(shù)量也在發(fā)生改變，由此推測(cè)這一變化可以作為預(yù)測(cè)疾病發(fā)生的標(biāo)志〔11〕。

Dogan等〔12〕發(fā)現(xiàn)降低VDR活性的Taq1多態(tài)性基因可能是患肺癌的危險(xiǎn)因素，而年齡、性別、吸煙可能加重這一因素的影響。秦皇島位于中國(guó)河北省東北部，為暖溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候有關(guān)，可能與研究對(duì)象種族差異、接觸致癌因素差異、環(huán)境暴露因素及未知的混雜因素有關(guān)。有必要在其他人群中重復(fù)實(shí)驗(yàn)以及進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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