董 輝 王素玲 李易明 王 磊 (華北石油總醫(yī)院急診科，河北 任丘 0655)

肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)不僅是導致肝衰竭、病人愈后較差的重要原因〔1，2〕，還可使遠端器官如心臟處于高度氧化應激狀態(tài)，遭受過氧化損傷〔3〕。氧化應激損傷是由活性氧族(ROS)造成的。ROS化學性質非?；顫?，可以破壞細胞內的重要結構蛋白和功能蛋白，甚至引起細胞和組織死亡〔4〕。過氧化物酶Ⅵ(PrxⅥ)有谷胱甘肽過氧化物酶的生物活性，主要負責還原H2O2和磷脂過氧化物等〔5～7〕。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)也是機體內清除ROS的重要酶系〔8～11〕。腦組織和心肌都是對氧含量高度敏感的器官，當肝臟發(fā)生缺血再灌注損傷后，腦組織是否也會受到氧化應激損傷?PrxⅥ、SOD和CAT等抗氧化酶的表達水平如何改變未見報道。本研究擬探討肝臟缺血再灌注損傷后腦內的氧化應激狀態(tài)以及PrxⅥ、SOD和CAT的抗氧化作用。

1 材料和方法

1.1 動物 選用健康雄性Wistar大鼠，體重(200±10)g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 瓊脂糖、溴乙啶、RT試劑盒、Taq DNA聚合酶、TRIzol均為Invitrogen公司產(chǎn)品;SOD、丙二醛(MDA)測定試劑盒均為南京建成生物公司產(chǎn)品;兔抗PrxⅥ抗體為Abcam公司產(chǎn)品;抗兔IgG抗體為Zymed公司產(chǎn)品;發(fā)光試劑為晶美生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器 HITACHI－7170全自動生化分析儀(日本);HITACHI UV－330紫外－可見分光光度計(日本);MJ Research PTC－200型 PCR 熱循環(huán)儀(美國);Leica－2145石蠟切片機(德國)。

1.4 動物模型的建立和取材 將大鼠隨機分為對照組(Con)和缺血再灌注損傷組(HIRI)，用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.5 ml/kg)，參照 Kohli等〔12〕的方法，分離肝血管和膽管蒂，以無創(chuàng)傷性血管夾夾閉通往肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂;30 min后去掉血管夾，恢復肝臟血液供應，制造70%肝實質的肝臟缺血再灌注損傷模型。對照組大鼠只分離血管和膽管蒂并不夾閉。6 h后收集血液，用于丙氨酸氨基轉移酶(ALT)測定;處死大鼠取肝臟和腦，一部分4%多聚甲醛固定進行HE染色，觀察肝組織和腦組織的形態(tài)學改變，一部分腦組織置于液氮中用于PrxⅥ、SOD和CAT mRNA、蛋白水平、抗氧化活性和MDA含量測定。

1.5 觀察指標

1.5.1 肝臟和腦組織的HE染色和形態(tài)學觀察 組織塊常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，切片厚5 μm，蘇木精伊紅染色，于光學顯微鏡下觀察肝臟和腦組織的形態(tài)變化并進行圖像分析。

1.5.2 血清ALT測定 未抗凝血經(jīng)3 000 r/min離心10 min，分離血清，ALT水平由全自動生化分析儀測定。

1.5.3 腦勻漿的制備和MDA含量測定 從－70℃冰箱中取出腦組織，按照 10 mg/100 μl加入預冷的勻漿緩沖液(50 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.4，1 mmol/L鹽酸苯甲脒，1 mmol/L PMSF，0.1%Tween－20，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTANa3，5 mmol/L β－巰 基 乙 醇)，冰 浴 中 勻 漿，勻 漿 液4 000 r/min 4℃離心20 min，取上清制成10%腦組織勻漿，其MDA含量經(jīng)MDA測定試劑盒測定。

1.5.4 腦組織內PrxⅥ，CAT、SOD mRNA水平測定 用TRIzol法提取腦內總 RNA。約3 μg總 RNA反轉錄成 cDNA。以GAPDH為內對照，進行 RT－PCR。分別以 PrxⅥ、SOD、CAT的擴增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

1.5.5 腦組織內CAT和SOD的活性測定 CAT、SOD的活性采用相應試劑盒測定。CAT和SOD的活性均以每毫克樣本蛋白所含的酶活性單位數(shù)(U/mg pro)表示，蛋白定量采用改良的Lowry法。

1.5.6 腦組織內PrxⅥ蛋白水平測定 采用Western印跡法測定大鼠腦內PrxⅥ蛋白水平。將大鼠腦組織制成勻漿，離心后取上清。用改良Lowry法進行蛋白總量測定。電泳的蛋白上樣量為68 μg。經(jīng)過轉膜和封閉處理后，在 PVDF膜上加入兔抗PrxⅥ抗體，室溫靜置過夜。再加入辣根過氧化物酶標記抗兔IgG抗體。按發(fā)光試劑操作說明進行顯影，定影，晾干。用凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片并分析圖像，以條帶的積分光密度值表示其蛋白含量。

表1 RT-PCR引物序列

2 結果

2.1 大鼠肝組織和腦組織的形態(tài)學改變 光學顯微鏡下可見對照組大鼠肝細胞排列成條索狀，圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝索間肝血竇大小均勻，無明顯擴張充血。而HIRI組大鼠的肝組織淤血嚴重，肝血竇明顯擴張充血，肝細胞受壓萎縮，肝細胞質染色變淺且有空泡出現(xiàn)，部分肝細胞水腫明顯，體積增大，染色變淺。腦組織在光學顯微鏡下兩組間未見明顯形態(tài)結構變化。見圖1。

圖1 兩組肝臟HE染色結果(×400)

2.2 血清ALT水平 Con組大鼠血清中ALT為(20.1±3.42)U/L，明顯低于 HIRI組〔(86.66±9.08)U/L〕(P ＜0.01)。

2.3 腦勻漿內MDA的含量 Con組大鼠腦內MDA的含量為(7.07 ±1.21)mmol/g pro，明顯低于 HIRI組 〔(12.37±2.11)mmol/g pro〕。(P ＜0.01)。

2.4 腦內PrxⅥ，SOD，CAT mRNA水平 對照組大鼠腦組織內 PrxⅥ、SOD、CAT mRNA表達量分別為 0.568±0.056，0.628±0.068，0.775±0.074;明顯低于 HIRI組(0.965±0.077，1.23±0.284，1.101±0.108)(P ＜0.01)。見圖2。

2.5 大鼠腦組織內SOD和CAT活性 Con組大鼠腦組織內SOD和 CAT活性分別為(228.07±22.4)、(28.5±1.61)U/mg pro，明顯低于 HIRI組〔(323.22±21.4)、(49.16±5.13)U/mg pro〕(P ＜0.01)。

2.6 大鼠腦組織內PrxⅥ的蛋白水平 HIRI組大鼠腦組織內PrxⅥ的蛋白表達水平(1.37±0.16)明顯高于對照組(0.79±0.12)(P＜0.01)。見圖3。

圖2 兩組PrxⅥ、SOD、CAT mRNA表達變化

圖3 兩組PrxⅥ的蛋白表達水平

3 討論

肝臟的HIRI不僅會導致肝臟自身的功能嚴重受損，還可影響到遠端器官的各種功能，如使心肌細胞處于高度氧化應激狀態(tài)〔3〕。腦組織和心肌細胞一樣都對氧含量極為敏感。本實驗結果顯示HIRI組大鼠血清內ALT的水平是對照組的4倍多。肝組織形態(tài)學的改變和血清ALT水平的顯著升高均證實HIRI模型成功。但與對照組相比，HIRI組大鼠的腦組織形態(tài)結構卻未見異常。

MDA是脂類過氧化最重要的終末代謝產(chǎn)物之一，其含量反映了機體脂質過氧化的速度和強度，常被作為反映組織過氧化損傷程度的客觀指標，并可間接反映細胞的損傷程度〔13〕。實驗結果顯示HIRI組大鼠腦內的MDA含量明顯高于對照組。說明雖然此時腦組織形態(tài)學尚未發(fā)生改變，但灌注損傷組大鼠腦內的ROS已經(jīng)增多，并導致脂類過氧化產(chǎn)物的大量堆積，提示腦組織可能已遭受氧化應激損傷。

PrxⅥ、SOD和CAT是清除ROS的主要酶系。肝臟缺血再灌注損傷組大鼠腦組織內PrxⅥ的mRNA水平和蛋白水平均明顯升高。SOD和CAT的抗氧化活性和mRNA水平也均明顯高于對照組。表明肝臟HIRI發(fā)生后可能通過某條途徑導致腦組織內ROS增多。過多的ROS襲擊腦組織，導致MDA等脂類過氧化產(chǎn)物的大量堆積。此時，腦組織通過上調PrxⅥ、SOD和CAT的表達量和抗氧化活性清除過多的ROS，避免腦組織進一步遭受氧化應激損傷。

總之，HIRI可導致腦組織處于高度氧化應激狀態(tài)，遭受過氧化損傷。通過上調PrxⅥ、SOD和CAT等抗氧化酶系表達水平來清除ROS，可能成為防治或減輕由HIRI誘發(fā)的大腦損傷的一條新途徑。

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