王曉凌 崔海平 趙瑞巧 (邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物化學(xué)教研室，河北 邢臺(tái) 054000)

嚴(yán)重糖尿病時(shí)血中膽汁酸水平明顯升高，臨床上糖尿病患者血中總膽汁酸水平被作為評(píng)價(jià)肝功能水平的一個(gè)重要指標(biāo)，但膽汁酸合成代謝有關(guān)基因在糖尿病進(jìn)程中的變化仍不十分清楚。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討糖尿病狀態(tài)下膽汁酸合成代謝的變化，以及血及膽汁中有關(guān)成分的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;OptiumTM血糖/血酮儀為美國(guó)Abbott Diabetes Care INC.生產(chǎn)，Mastercycler Pro PCR儀為德國(guó)Effendorf公司產(chǎn)品，GIS-1000凝膠成像分析系統(tǒng)為天能科技(上海)有限公司生產(chǎn);AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶購(gòu)自Fermentas，鏈脲佐菌素(STZ)為Sigma公司產(chǎn)品;胰島素放射免疫試劑盒購(gòu)自北方生物技術(shù)研究所，血糖、甘油三酯、總膽汁酸、磷脂和膽固醇測(cè)定試劑盒購(gòu)自浙江東甌生物工程有限公司。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 分組和建模 3月齡雄性SD大鼠35只，隨機(jī)分為對(duì)照組15只和糖尿病組20只。對(duì)照組喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料(熱量組成為糖65.5%，脂肪0.3%，蛋白質(zhì)24.2%);DM組喂養(yǎng)高脂飼料(熱量組成為糖20.1%，脂肪59.8%，蛋白質(zhì)20.1%)，其中脂肪主要為豬油。高脂食物喂養(yǎng)8 w，通過口服糖耐量試驗(yàn)(OGTT)、胰島素敏感指數(shù)(ISI)驗(yàn)證是否產(chǎn)生胰島素抵抗。

1.2.2 口服糖耐量試驗(yàn)(OGTT)和胰島素敏感指數(shù)(ISI)的測(cè)定 用50%葡萄糖(2 g/kg)空腹灌胃，割尾取血，用血糖/血酮快速測(cè)定儀檢測(cè)灌胃0、30、60、120 min血糖，分析兩組大鼠血糖水平隨時(shí)間的變化確定OGTT。間隔數(shù)日后，大鼠空腹12 h，眼內(nèi)眥靜脈叢采血，檢測(cè)各組大鼠胰島素水平和空腹血糖水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)。胰島素敏感指數(shù)=ln1/(空腹血糖濃度 ×空腹血胰島素濃度)。

1.2.3 取材 產(chǎn)生胰島素抵抗的DM組大鼠空腹注射小劑量STZ(30 mg/kg)，3 d后禁食12 h，測(cè)定空腹血糖。血糖值 ＞7.8 mmol/L的15只大鼠繼續(xù)用高脂飼料喂養(yǎng)4 w，在飼養(yǎng)過程中有2只死亡。從對(duì)照組和糖尿病組隨機(jī)選取10只大鼠，禁食不禁水12 h，1.2 g/kg烏拉坦腹腔注射麻醉，開腹后在十二指腸上方橫斷膽總管，插入硬膜外導(dǎo)管并結(jié)扎固定，收集膽汁1 h，置－80℃冰箱保持，用于測(cè)定膽汁中膽汁酸、卵磷脂和膽固醇的含量;膽汁收集結(jié)束后，股動(dòng)脈采血，3 000 r/min分離血清，用于檢測(cè)血液生化指標(biāo);迅速取出肝臟，置于液氮中，分裝后－80℃凍存，用于測(cè)定肝組織膽固醇含量，檢測(cè)膽汁酸代謝有關(guān)基因的表達(dá)。

1.2.4 血清和膽汁中生化指標(biāo)的測(cè)定 血中葡萄糖、甘油三酯、膽固醇利用氧化酶法測(cè)定;血和膽汁中總膽汁酸測(cè)定采用循環(huán)酶法，膽汁中磷脂測(cè)定采用酶比色法，用HITACHI 7170A型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。血中胰島素利用試劑盒，人工放射免疫法測(cè)定。

1.2.5 膽汁酸代謝有關(guān)基因的mRNA表達(dá) 用Trizol法提取肝組織總RNA，用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板，PCR擴(kuò)增以下基因:①調(diào)節(jié)膽固醇和膽汁酸代謝的肝X受體α(LXRα);②肝膽汁酸合成的限速酶膽固醇7α羥化酶(CYP7A1);③參與肝細(xì)胞將膽固醇轉(zhuǎn)移到膽汁中的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 G5和 G8(ABCG5和 ABCG8);④內(nèi)參照 β-actin。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)成像分析系統(tǒng)分析，分別得到目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物與內(nèi)參照β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物的積分光密度值(IOD)，以二者的比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。各基因引物見表1。

2 結(jié)果

2.1 血中生化指標(biāo) 與對(duì)照組相比，DM大鼠空腹血糖，甘油三酯、膽固醇、膽汁酸以及胰島素敏感指數(shù)明顯升高(P＜0.01)，體重明顯增高(P＜0.05)。表明該模型大鼠為2型糖尿病肥胖大鼠。見表2。

表1 各基因RT-PCR引物

表2 大鼠血生化指標(biāo)(±s，n=10)

表2 大鼠血生化指標(biāo)(±s，n=10)

與對(duì)照組相比:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 體重(g) 空腹血糖(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)膽固醇(mmol/L)膽汁酸(μmol/L)胰島素(μIU/ml)胰島素敏感指數(shù)對(duì)照組 441.5±32.6 5.29±0.46 1.01±0.30 1.75±0.15 128.97±17.10 18.69±3.95 －4.57±0.26糖尿病組 483.4±34.51) 15.84±2.472) 2.23±0.512) 2.95±0.492) 365.33±27.582) 20.97±5.32 －5.76±0.372)

2.2 膽汁中膽固醇、磷脂和膽汁酸的含量 與對(duì)照組相比較，糖尿病組大鼠膽汁中膽汁酸和膽固醇含量均有明顯增加(P＜0.01)，磷脂含量也有一定增加(P＜0.05)，但膽汁酸和磷脂濃度總和與膽固醇濃度比值下降(P＜0.01)。見表3。

表3 大鼠膽汁生化指標(biāo)(±s，n=10)

表3 大鼠膽汁生化指標(biāo)(±s，n=10)

與對(duì)照組相比:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 膽汁酸(mmol/L)磷脂(mmol/L)膽固醇(mmol/L)膽汁酸+磷脂/膽固醇對(duì)照組27.75±3.39 7.34±1.08 8.31±1.09 4.30±0.78糖尿病組46.99±8.232)8.69±1.391)22.41±3.122)2.52±0.442)

2.3 膽汁酸代謝有關(guān)基因的表達(dá) 糖尿病組LXRα、CYP7A1、ABCG5和ABCG8 mRNA水平均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05或P ＜0.01)。見圖1，表4。

圖1 膽汁酸代謝有關(guān)基因的表達(dá)

表4 膽汁酸代謝有關(guān)基因的表達(dá)(±s，n=6)

表4 膽汁酸代謝有關(guān)基因的表達(dá)(±s，n=6)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 LXRαCYP7A1 ABCG5 ABCG8對(duì)照組0.66±0.15 0.35±0.07 0.29±0.08 0.26±0.07糖尿病組 0.92±0.191)0.61±0.162)0.51±0.191)0.60±0.162)

3 討論

膽汁酸生成是膽固醇排出體外的最主要途徑。CYP7A1是膽固醇經(jīng)典合成途徑中的關(guān)鍵酶，屬于肝細(xì)胞微粒體細(xì)胞色素P450酶系，其啟動(dòng)子區(qū)域有 LXRα的順式作用元件〔1〕。ABCG5、ABCG8是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G家族的成員，在二者的啟動(dòng)子部位也存在LXRα的順式作用元件〔2〕。核受體LXRα被其配體激活后，先與維甲酸X受體(RXR)形成異二聚體，再作用到下游基因CYP7A1、ABCG5、ABCG8等的順式元件，通過調(diào)控其下游基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)膽汁酸代謝。本研究中LXRα及其靶基因CYP7A1、ABCG5、ABCG8的mRNA表達(dá)增加，說明在糖尿病狀態(tài)下LXRα被激活。CYP7A1表達(dá)增加促進(jìn)肝臟膽汁酸的合成，引起膽汁中膽汁酸濃度增高;ABCG5、ABCG8是跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，促進(jìn)肝合成的膽汁酸排入膽汁，它們的表達(dá)增加可以解釋膽汁中膽固醇濃度的增加。

2型糖尿病狀態(tài)下大鼠肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重的脂質(zhì)沉積，脂肪和膽固醇沉積于肝細(xì)胞。膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼崾悄懝檀寂判沟闹饕緩?，本研究中肝?xì)胞膽汁酸合成增加，有利于減少肝膽固醇的沉積，可能是對(duì)膽固醇合成增加的一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病模型鼠膽汁中膽汁酸、磷脂、膽固醇濃度均增加，但膽汁酸和磷脂濃度總和與膽固醇濃度比值下降。膽固醇是脂溶性物質(zhì)，它的運(yùn)輸需要膽汁酸和磷脂的協(xié)助，膽汁酸和磷脂濃度總和與膽固醇濃度比值下降不利于膽固醇的正常運(yùn)輸，易導(dǎo)致膽固醇在膽汁中的沉積。有研究報(bào)道糖尿病患者膽結(jié)石發(fā)生率明顯增高〔3，4〕，但也有研究認(rèn)為兩者無關(guān)〔5〕，本研究提示2型糖尿病狀態(tài)下膽結(jié)石的發(fā)生概率增大。

1 Lehmann JM，Kliewer SA，Moore LB，et al.Activation of the nuclear receptor LXR by oxysterols defines a new hormone response pathway〔J〕.J Biol Chem，1997;272(6):3137-40.

2 Freeman LA，Kennedy A，Wu J，et al.The orphan nuclear receptor LRH-1 activates the ABCG5/ABCG8 intergenic promoter〔J〕.J Lipid Res，2004;45(7):1197-206.

3 Pagliarulo M，F(xiàn)ornari F，F(xiàn)raquelli M，et al.Gallstone disease and related risk factors in a large cohort of diabetic patients〔J〕.Dig Liver Dis，2004;36(2):130-4.

4 Shebl FM，Andreotti G，Rashid A，et al.Diabetes in relation to biliary tract cancer and stones:a population-based study in Shanghai，China〔J〕.Br J Cancer，2010;103(1):115-9.

5 Bodmer M，Brauchli YB，Jick SS，et al.Diabetes mellitus and the risk of cholecystectomy〔J〕.Dig Liver Dis，2011;43(5):742-7.