寇 煒 蘭詠梅 李培強(qiáng) 劉金英 周云松 (西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

高脂血癥(HI)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)、腦梗死、心肌梗死等疾病的重要危險因素，高脂血癥發(fā)病受遺傳和環(huán)境等因素影響。研究證實多種載脂蛋白(APO)基因的多個位點變異均對血脂水平有一定的影響，臨床流行病學(xué)調(diào)查則顯示在不同地區(qū)、不同人群中的研究結(jié)果不盡相同〔1〕。載脂蛋白B(ApoB)是血漿乳糜微粒，極低密度脂蛋白及低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白質(zhì)，它與血漿膽固醇和甘油三酯的運(yùn)輸與代謝密切相關(guān)，在調(diào)節(jié)LDL分解代謝及血漿膽固醇水平中起主要作用。大量流行病研究表明，血漿膽固醇和ApoB水平升高是發(fā)生動脈粥樣硬化和冠心病的主要危險因素〔2〕。目前，中國人群血脂異常的現(xiàn)狀不容樂觀，鑒于血脂異常發(fā)生率高，危害嚴(yán)重，本文選擇ApoB基因的rs676210位點，以甘肅省特有少數(shù)民族裕固族人群為研究對象，采用MALDI-TOF的方法觀察其與血漿脂質(zhì)水平的相關(guān)性，從分子水平探討ApoB基因在高脂血癥中發(fā)生發(fā)展中的作用，為血脂異常及相關(guān)疾病的防治提供幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象 采用整群抽樣方法，將聚居于甘肅肅南地區(qū)裕固族自治縣境內(nèi)的裕固族居民464人作為研究對象，男233人，女231人;病例組(224人)，健康體檢者(240人);年齡38～70歲，平均年齡(42.18±13.49)歲。受試者均簽署知情同意書。

1.1.1 血脂異常診斷標(biāo)準(zhǔn)〔3〕TC≥5.72 mmol/L為高膽固醇血癥，TG≥1.70 mmol/L為高甘油三酯血癥，LDL-C≥3.64 mmol/L為高低密度脂蛋白血癥，HDL-C≤0.91 mmol/L為低高密度脂蛋白血癥。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 純合子家族性高膽固醇血癥或藥物引起的高脂血癥者;妊娠婦女、哺乳期婦女;半年內(nèi)曾患急性心肌梗死、腦血管意外、嚴(yán)重創(chuàng)傷或重大手術(shù)者;腎病綜合征或腎功能不全、甲狀腺功能減退、嚴(yán)重高血壓、急性或慢性肝、膽、胰疾病、糖尿病、過敏體質(zhì)及急性炎癥期患者及有嚴(yán)重?zé)?、酒嗜好者?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 試劑和儀器 DNA試劑盒為上海中能生物技術(shù)公司提供，全自動生化分析儀分析為Beckman CX4 Pro，質(zhì)譜儀為美國ABI公司的MALDI-TOF 4700。

1.2.2 標(biāo)本收集 所有被檢者空腹12 h以上，次日清晨抽取空腹靜脈血，一管用EDTA-K2抗凝，供提取基因組DNA用;另一管肝素抗凝，現(xiàn)場離心后，置－20℃保存。

1.2.3 血脂檢測 采用全自動生化分析儀分析檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C，所有上述指標(biāo)檢測均由西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實驗室完成。

1.2.4 APOB基因位點多態(tài)性檢測

1.2.4.1 樣品制備 采用血液基因組DNA小量抽提試劑盒，從血液中抽提白細(xì)胞基因組DNA，－20℃保存。

1.2.4.2 質(zhì)譜分析 取1 μl上清液點置于MALDI樣品靶上，晾干，點1 μl基質(zhì)溶液，再晾干備用。Smart Beam激光器，波長355 nm，每個樣品譜圖累積500個激光脈沖信號，質(zhì)量范圍(m/z)220 kD，延遲提取時間200 ns，加速電壓20 kV，提取電壓18.6 kV，聚焦電壓6.5 kV。每個樣品測定15張蛋白質(zhì)量圖譜，然后提取特征峰信息，以獲得可靠均值，采用Mass ARRAY system(Sequenom，San Diego，CA)方法進(jìn)行多態(tài)性分析。此外，基因型分析的操作人員不知道所檢測標(biāo)本的病例或?qū)φ諏傩?上述質(zhì)譜分析過程在深圳華大基因科技有限公司完成)。

2 結(jié)果

2.1 高脂血癥組和健康對照組的血脂水平比較 經(jīng)χ2檢驗表明，ApoB基因rs676210基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。表明本研究人群APOB基因rs676210基因型分布已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。見表1。

表1 高脂血癥組和健康對照組的血脂水平比較(±s)

表1 高脂血癥組和健康對照組的血脂水平比較(±s)

與健康對照組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

組別 n 年齡(歲) 男/女 TC(mmol/L) TG(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L)高脂血癥組 224 53±16 142/80 6.53±0.401) 2.29±0.401) 3.69±0.321) 1.82±0.302)健康對照組 240 50±13 124/116 4.35±0.36 1.24±0.34 2.85±0.35 1.58±0.27

2.2 兩組各基因型及等位基因頻率比較 ApoB基因rs676210各基因型在兩組人群中的分布差異有顯著性(P＜0.05);等位基因頻率在兩組人群中的分布差異也有顯著性(P＜0.001);等位基因頻率的相對風(fēng)險分析發(fā)現(xiàn)，rs676210位點G等位基因攜帶者患高脂血癥組的風(fēng)險是A等位基因的5.583倍(OR=1.641，95%CI=1.086～2.479)。見表2。

表2 高脂血癥組和健康對照組rs676210位點基因型和等位基因頻率的比較〔n(%)〕

2.3 ApoB基因的rs676210基因多態(tài)性對血脂代謝的影響在高脂血癥組中，AG及GG基因型者的TC水平明顯高于AA型(P＜0.01)，AG、GG基因型HDL-C水平明顯低于AA型(P＜0.05);在健康對照組中，各基因型的各項血脂指標(biāo)均未見差異(P＞0.05)。見表3。

表3 高脂血癥組和對照組不同基因型及等位基因血脂水平比較(±s，mmol/L)

表3 高脂血癥組和對照組不同基因型及等位基因血脂水平比較(±s，mmol/L)

與健康對照組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

組別AA AG GG高脂血癥組n 74 110 40 TC 6.21±0.22 6.67±0.481) 6.74±0.541)TG 2.27±0.38 2.29±0.40 2.31±0.46 LDL-C 3.71±0.36 3.68±0.32 3.67±0.33 HDL-C 1.96±0.37 1.75±0.232) 1.76±0.232)健康對照組n 130 86 24 TC 4.34±0.32 4.39±0.40 4.37±0.38 TG 1.22±0.33 1.24±0.34 1.26±0.35 LDL-C 2.83±0.31 2.88±0.33 2.84±0.35 HDL-C 1.59±0.29 1.58±0.27 1.57±0.26

3 討論

ApoB基因位于人類第2號染色體p23-24，全長43 kb，含有28個內(nèi)含子和29個外顯子〔4〕，有顯著差異和明顯的多態(tài)性，是LDL和VLDL中主要的載脂蛋白，對維持體內(nèi)血脂水平的恒定具有重要作用。ApoB基因與其他載脂蛋白的結(jié)構(gòu)相比較有顯著的差異，存在多個遺傳突變位點，已被認(rèn)為是促使動脈粥樣硬化(AS)與冠心病(CHD)的危險因子〔5〕。有調(diào)查顯示，心血管病已經(jīng)成為我國城市和鄉(xiāng)村人群的第一位死亡原因〔6〕，在經(jīng)濟(jì)發(fā)展較快的大城市，缺血性腦卒中發(fā)病率明顯升高〔7〕，預(yù)示以AS為基礎(chǔ)的缺血性心血管病(包括CHD和缺血性腦卒中)發(fā)病率正在升高。為此，對血脂異常的防治必須及早給予重視。

ApoB基因的一個或幾個位點的微小變異或缺陷都會引起個體血脂增高，最后導(dǎo)致AS或CHD。ApoB基因多態(tài)性與血漿脂質(zhì)水平，AS和CHD的關(guān)系，國外已有不少報道，但結(jié)果不完全一致，且大多以西方高加索人種為研究對象〔8～11〕。Kathiresan等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)LDL水平升高、HDL水平降低及TG水平是心血管疾病重要的獨(dú)立危險因素，并發(fā)現(xiàn)ApoB基因rs693位點的A等位基因與LDL及TG水平的升高相關(guān)。Rebhil〔13〕對北非人的研究亦發(fā)現(xiàn)ApoB基因5'Ins/Del和3'vNTR多態(tài)性影響血脂水平，增加CHD易感性。蘇上貴〔14〕等報道廣西壯族和漢族人之間存在差異，E+等位基因是廣西漢族人群CHD的易感基因，而對廣西壯族人群無影響。另國外對白人的研究發(fā)現(xiàn)，英美白人與挪威白人之間E+等位基因與血脂和CHD的相關(guān)性也存在顯著的不一致性〔15〕。國內(nèi)外研究均顯示ApoB基因多態(tài)性與血脂代謝及CHD相關(guān)聯(lián)，但群體不同得到的關(guān)聯(lián)程度不同，可能是不同群體和民族的關(guān)聯(lián)表現(xiàn)在不同的遺傳背景和環(huán)境背景。

目前，在人類ApoB基因已發(fā)現(xiàn)多個位點與血脂水平和心腦血管病相關(guān)，而本研究中所涉及的rs676210位點單核苷酸多態(tài)性在國內(nèi)還未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)對于裕固族人群來說，高脂血癥組AA、AG和GG基因型的頻率與健康對照組相比差異顯著。同時，在高脂血癥組中，AG及GG基因型者的TC水平明顯高于AA型，AG、GG基因型HDL-C水平明顯低于AA型。而風(fēng)險分析顯示G等位基因是高脂血癥的一個獨(dú)立危險因素，rs676210位點G等位基因的攜帶者其風(fēng)險性較高，因此筆者推測ApoB基因的rs676210位點的AG及GG基因型和G等位基因攜帶者具有高脂血癥易感性，與高脂血癥患者的血脂水平升高存在關(guān)聯(lián)性，可能是裕固族人群高脂血癥的易感基因。

總之，本研究初步從分子基因水平對甘肅省肅南地區(qū)裕固族人群ApoB基因多態(tài)性與高血脂的相關(guān)性進(jìn)行了分析，從基因水平尋找血脂代謝紊亂的危險因素，篩選血脂代謝紊亂的易感基因，可以為脂代謝紊亂個體的遺傳危險度評價提供重要依據(jù)，為脂代謝紊亂及其相關(guān)的心血管疾病的預(yù)防提供可行的手段，并可為它們的治療提供新思路，因而對預(yù)防、篩選及早期診治這些人群血脂異常具有一定的基礎(chǔ)和臨床意義。

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