王升陽 張勇 王健 劉言志 劉金亮 潘洪玉

植物抗病原物侵染反應(yīng)與多種生理生化調(diào)節(jié)相關(guān)，其中包括細胞壁木質(zhì)化、植物抗毒素的合成、病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related proteins，PRP）基因的表達，這些蛋白如幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶等。PRP根據(jù)序列相似性及免疫學(xué)相關(guān)性分為17個家族［1］，其中病程相關(guān)5（PR-5）蛋白是第5家族，具有β-1，3葡聚糖酶、抗真菌侵染、抗凍、抗?jié)B透壓力等多種生物學(xué)活性，參與植物系統(tǒng)獲得抗性（SAR）和過敏反應(yīng)（HR），在植物抵御生物和非生物脅迫中具有重要作用［2］。另外，PR-5蛋白與甜蛋白的氨基酸序列同源性高，也被稱為類甜蛋白（thaumatin-like protein，TLP）。同時，由于 PR-5 蛋白獨特的抗真菌活性，良好的穩(wěn)定性，而且對人體無毒，使它成為一種潛在的綠色抑菌藥劑。PR-5 蛋白包含了具有多種抗逆功能的滲調(diào)蛋白（osmotin）和類滲調(diào)蛋白（osmotin-like protein，OLP）。在植物體中，osmotin 是一種陽離子蛋白，OLP 與osmotin相比，pI偏低，并富含絲氨酸、蘇氨酸，可能使它在植物中具有不同的生理生化功能［3］。Osmotin最初作為在高濃度NaCl環(huán)境中培養(yǎng)的煙草細胞中主要積累的一種蛋白而分離得到［4］；許多研究已經(jīng)證明，OLP可被微生物侵染和多種非生物脅迫因素激活表達［5］。目前，盡管人們還不完全清楚OLP的生物功能，但是一些試驗已經(jīng)證明OLP可作為一種抗真菌的體外蛋白［6］。目前，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)從大洋洲濱藜（Atriplex nummularia）、番茄（Lycopersicon esculentum）、阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）、野海茄（Solanum dulcamara）、辣椒（Capsicum annuum）等植物中克隆了osmotin-like protein基因。迄今為止，有關(guān)四翅濱藜o(jì)smotin-like protein基因的研究還鮮有報道。本試驗從四翅濱藜的cDNA文庫中篩選出AcOLP基因，并對其進行序列分析和原核表達的相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

四翅濱藜cDNA文庫大腸桿菌菌株DH10B由本實驗室構(gòu)建并保存；大腸桿菌E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）菌株與表達載體pET-28a由本實驗室提供；克隆載體pMD18-T Vector購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 文庫目標(biāo)克隆子的獲得 隨機挑選文庫克隆，提取質(zhì)粒DNA，以載體pYES-DEST52上游（T7）：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'和下游（R）：5'-AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3'為測序引物，進行全序列測定得到EST序列，然后在NCBI BLASTX庫進行比對。

1.2.2 AcOLP基因的克隆及測序 根據(jù)目的基因序列，設(shè)計合成一對PCR擴增特異性引物。上游引物：5'-CGGGATCCATGAATTCCTCCTTGATGAAAT C-3'，下劃線為BamHⅠ酶切位點；下游引物：5'-CCCTCGAGTCAAGGACAAAATGTAACTAC-3'，下劃線為Xho Ⅰ酶切位點。以四翅濱藜cDNA為模板進行 PCR，反應(yīng)體系（25.0μL）為 ：ddH2O 18.0μL、10×Pfu PCR Buffer（含 Mg2+）2.5μL、Forward Primer 1.0μL、Reverse Primer 1.0μL、dNTPs 1.0μL、Template 1.0μL、Pfu 酶0.5μL。反應(yīng)程序為 ：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30 s、72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測鑒定正確后，進行回收，將回收的AcOLP基因片段進行加“A”反應(yīng)后與pMD18-T Vector連接，連接反應(yīng)按照試劑盒說明書進行，16℃條件下連接1h，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18T-AcOLP。連接產(chǎn)物用CaCl2化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，LB（Amp+）平板上37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑取平板上的單菌落，接種于LB（Amp+）液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和Xho Ⅰ雙酶切驗證、PCR鑒定，將獲得的3個陽性重組質(zhì)粒送至Invitrogen公司測序。根據(jù)測序結(jié)果進行序列比較和分析。

1.2.3 AcOLP基因的原核表達 用BamHⅠ和XhoⅠ對重組質(zhì)粒pMD18T-AcOLP、表達載體pET-28a分別進行雙酶切，電泳檢測，回收，以T4 DNA連接酶于16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coli DH5α中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于50mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。按照上述方法對平板上挑取的菌落進行酶切驗證和PCR鑒定。將獲得的原核融合表達重組質(zhì)粒pET28a-AcOLP轉(zhuǎn)化BL21（DE3）受體菌株中。PCR和酶切驗證正確后，挑取其陽性克隆接種于3mL含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，以1∶100的比例擴大培養(yǎng)，當(dāng)OD600至0.4-0.6時，加IPTG至終濃度為1mmol/L，分別誘導(dǎo)0、2、4、6和8h。離心收集菌體，加入1/10體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸10min，進行SDS-PAGE電泳。

2 結(jié)果

2.1 四翅濱藜o(jì)smotin-like protein基因的克隆

以四翅濱藜cDNA為模板，用所設(shè)計的特異性引物進行PCR擴增，對其產(chǎn)物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，大約在700bp出現(xiàn)明顯特異性條帶（圖1）

圖1 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2 序列測定與分析

2.2.1 結(jié)構(gòu)域和保守性分析 選取質(zhì)粒PCR鑒定表現(xiàn)出陽性克隆及酶切鑒定可以切出目的片段的菌株進行測序。測序結(jié)果表明，AcOLP基因包含有全長為687bp開放閱讀框，編碼的多肽鏈含有229個氨基酸。將得到的序列提交GenBank，序列號為JN632587.1。以ExPASy網(wǎng)站的Compute pI/Mw tool計算可得AcOLP的等電點為6.04，分子量為24.07kD。在NCBI網(wǎng)站上對AcOLP基因編碼的氨基酸序列進行保守區(qū)域分析。分析結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)共有229個氨基酸殘基，屬于GH64-TLP-SF超家族，是一種病程相關(guān)5（PR-5）蛋白。推導(dǎo)的AcOLP氨基酸全長序列與其他植物中相關(guān)的PR-5蛋白序列的比對結(jié)果，如圖2所示。AcOLP含有17個Cys殘基，其中16個在PR-5蛋白中是高度保守的，可能與二硫鍵的形成有關(guān)［7］；在N端1-28氨基酸為預(yù)測的信號肽序列，可能與osmotin-like protein在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的跨膜轉(zhuǎn)運有關(guān)，信號肽的最后一個氨基酸為Ala，這在osmotin-like protein也是較為保守的［8］。

圖2 六種PR-5蛋白氨基酸序列比對圖

2.2.2 序列同源性分析 AcOLP與其他物種的相關(guān)序列有較高的同源性。核酸序列同源性分析表明，AcOLP基因與大洋洲濱藜o(jì)smotin-like protein基因（M84468.1）同源性最高，為94％；與其它植物如大米草（Spartina anglica）、西藏南美藜（Chenopodium quinoa）的osmotin-like protein基因的同源性也在81％以上。AcOLP基因編碼的蛋白序列與大洋洲濱藜o(jì)smotin-like protein蛋白（AAA32909.1）序列同源性達87％，與上述其他植物中的PR-5蛋白序列同源性基本都在50％以上。表明osmotin-like protein合成過程在植物進化中屬于較保守進化。

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析 利用MEGA5.05軟件對四翅濱藜、大洋洲濱藜、燕麥（Avena sativa）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、西藏南美藜等的PR-5蛋白序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖（圖3），可以看出，比對的PR-5蛋白被分成了兩大類，四翅濱藜與大洋洲濱藜的親緣關(guān)系最近，四翅濱藜、大洋洲濱藜、西藏南美藜比對的PR-5蛋白屬于類滲調(diào)蛋白（osmotin-like protein，OLP）。

圖3 四翅濱藜與部分物種PR-5蛋白氨基酸推導(dǎo)序列系統(tǒng)進化樹

2.3 AcOLP基因原核表達

將鑒定為陽性的pET28a-AcOLP BL21（DE3）菌體經(jīng)過終濃度為1mmol/L的IPTG分別誘導(dǎo)0、2、4、6和8h。將誘導(dǎo)表達的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果（圖4）表明在29kD處出現(xiàn)一條特異性蛋白帶，與預(yù)期大小一致，說明AcOLP基因編碼的蛋白在大腸桿菌中得到了正確的表達。并且隨著誘導(dǎo)時間的增加，目的蛋白的表達量逐漸增加，到4h達最大值。

圖4 AcOLP在大腸桿菌BL21（DE3）中表達的SDSPAGE電泳圖

3 討論

我們從四翅濱藜cDNA文庫中克隆了AcOLP基因，測序結(jié)果和同源性分析表明該基因編碼蛋白屬于PR-5家族蛋白，同時將獲得的AcOLP基因連接到原核表達載體上誘導(dǎo)其原核表達。有關(guān)研究表明，osmotin-like protein能抵抗致病疫霉（Phytophthora infestans）的侵染，致病疫霉可引起馬鈴薯和番茄的晚疫病，但是目前還不清楚其高度保守的Cys是否與抗真菌作用有關(guān)。Osmotin-like protein可被多種非生物因素和生物因素所誘導(dǎo)，例如，ABA、SA、高濃度鹽溶液、機械損傷、低溫、真菌侵染，說明這種蛋白在滲透脅迫和抵御病原體侵染方面的雙重功能［9］。金屬陽離子影響PR-5蛋白與真菌細胞壁受體的作用。一種來源于煙草的PR-5蛋白osmotin，對其與酵母抑制作用進行研究，發(fā)現(xiàn)酵母細胞壁上聚甘露糖上的一個磷酸化位點是osmotin的受體［10］，而且其結(jié)構(gòu)中的酸性凹槽是osmotin作用位點，此外這2個位點都是帶負電荷。K+通過與磷酸基團結(jié)合影響osmotin與它的結(jié)合，從而抑制osmotin 在菌體細胞壁上的識別；此外，Ca2+會與K+競爭結(jié)合受體，能促進osmotin與磷酸基團的互相結(jié)合，因而增強 osmotin對菌體的毒性［11］。Osmotin-like protein較osmotin pI值偏低，因而可能具有更強的抗菌作用。而這一研究被運用在草莓貯運過程中，草莓被含Ca2+的溶液處理后，草莓在貯運中的腐敗減少［12］，而且從草莓中發(fā)現(xiàn)的2個PR-5蛋白FaOLP［13］和FaOLP2［14］也驗證了這一點。因此，本研究結(jié)果為osmotin-like protein的體外活性測試和通過植物基因工程提高植物的抗病性研究提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從四翅濱藜cDNA文庫中擴增并克隆了AcOLP基因，測序結(jié)果和同源性分析表明，osmotinlike protein基因在高等植物的PR-5蛋白基因間保守性較高，四翅濱藜和大洋洲濱藜的osmotin-like protein的N-信號肽序列完全一致。AcOLP中含有16個保守的Cys，與二硫鍵的形成有密切的關(guān)系，有利于AcOLP結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。將AcOLP基因與原核表達載體pET-28a連接，進行融合表達，在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達出分子質(zhì)量約29kD的蛋白。

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