劉靜 周志軍 常巖林

生殖干細胞（germline stem cells，GSC）是精巢和卵巢中配子發(fā)生的中樞，GSC的自我更新與分化在動物體內(nèi)保持平衡，從而使GSC和成熟配子的數(shù)量保持穩(wěn)定［1］。關于GSC的研究在模式生物果蠅中最為深入。Piwi基因廣泛存在于各種多細胞生物類群的干細胞之中。迄今為止，尚沒有關于其在半變態(tài)昆蟲中研究的報道。Lin和Spradling［2］首先在果蠅卵巢中發(fā)現(xiàn)piwi基因?qū)SC的分裂有調(diào)控作用。隨后，Cox等［3，4］證明piwi基因在果蠅雌性和雄性GSC中以自主方式表達并促進GSC分裂。Piwi蛋白通過與piRNA（Piwi-interacting RNA）結合形成Piwi-piRNA復合物引起基因沉默，進而對生殖細胞進行調(diào)控［5-7］。目前在多種生物（如人、小鼠、斑馬魚、線蟲）中都有果蠅piwi基因的同源基因發(fā)現(xiàn)，piwi基因的突變可導致生殖細胞發(fā)育缺陷［4，8-12］。

雖然近年來已對多種昆蟲的piwi同源基因進行了研究［13，14］，但昆蟲種類繁多，生殖方式多樣，生殖生理差異較大。已研究的果蠅、蜜蜂、家蠶均為完全變態(tài)類昆蟲，其卵巢管為滋養(yǎng)式（meroistic type），piwi基因在生殖干細胞龕（stem cell niche）的端絲和冠細胞中均有表達［4］，piwi基因突變導致GSCs過早丟失［15］。直翅目為不完全變態(tài)類昆蟲，其卵巢管是無滋式（panoistic type），卵子發(fā)生過程中沒有滋養(yǎng)細胞提供營養(yǎng)和信號［16］。無滋式的直翅目昆蟲卵巢是否存在調(diào)控GSC發(fā)育的因子，是否存在Piwi蛋白同源物，GSC發(fā)育的調(diào)控模式等尚無報道。

優(yōu)雅蟈螽（Gampsocleis gratiosa）隸屬于昆蟲綱（Insecta）直翅目（Orthopter）螽斯總科（Tettigonoidea），是直翅目重要的模式昆蟲。本研究利用piwi基因主要表達于生殖細胞的特點，通過轉錄組測序（RNASeq）、RACE-PCR及相關生物信息學技術，對優(yōu)雅蟈螽雌性成蟲卵巢中piwi同源基因及預測的蛋白序列進行分析，為厘清無滋式卵巢管的原卵區(qū)（germarium）內(nèi)部細胞的組成及GSC龕模式在不完全變態(tài)昆蟲是否適用等問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試用的優(yōu)雅蟈螽采自河北省順平縣（38 83' N，115 13' E），將捕獲的末齡若蟲帶回實驗室內(nèi)飼養(yǎng)至成蟲。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 選取發(fā)育良好的優(yōu)雅蟈螽雌性成體，快速解剖取出卵巢置于含有RNAiso Plus（TaKaRa）的勻漿器中，充分研磨，進行總RNA提取。具體操作依照RNAiso Plus試劑盒說明書進行，提取獲得的總RNA溶解于RNase-free（TIANGEN）無菌水中。

1.2.2 引物設計 通過對本實驗室前期測得的優(yōu)雅蟈螽轉錄組數(shù)據(jù)進行搜索，篩選出與昆蟲piwi基因同源的序列片段。由于piwi基因序列全長接近3 kb，因此將中間段序列分為A、B、C 3個互相重疊的片段進行引物設計。利用Primer Premier 5.0［17］軟件，共設計了3對中間段序列擴增引物（GAF/GAR，GBF/GBR，GCF/GCR）和4條基因兩端RACE引物（G3F1，G3F2，G5F1，G5F2）（表 1），并交由上海鉑尚生物技術有限公司合成。

1.2.3 cDNA第一條鏈合成 用Oligo dT引物對總RNA（約1μg）進行反轉錄，具體操作依照Prime-Script?RT-PCR Kit（TaKaRa）試劑盒說明書進行。

1.2.4 piwi基因中間段序列RT-PCR 以反轉錄得到的cDNA為模板，分別用GAF/GAR，GBF/GBR，GCF/GCR引物對進行擴增。擴增程序：94℃預變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

表1 RACE-PCR引物

1.2.5 piwi基因3'/5'端RACE-PCR反應 3'RACE依照3'-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒說明書對總RNA（約1μg）進行反轉錄。反應程序：42℃ 60min，70℃ 15min。以反轉錄得到的cDNA為模板，用G3F1和3' Outer Primer及G3F2和3' Inner Primer分別進行Outer PCR擴增和Inner PCR擴增。反應程序：94℃預變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min（Outer PCR 20個循環(huán)/Inner PCR 30個循環(huán)）；72℃延伸10min。5' RACE依照5'-Full RACE Kit試劑盒說明對總RNA（約2μg）進行去磷酸化、去帽子、5' RACE Adaptor連接及反轉錄反應。反應程序：30℃ 10min，42℃ 1h，70℃15min。以反轉錄得到的cDNA為模板，用5' Outer Primer和G5R1及5' Inner Primer和G5R2分別進行Outer PCR和Inner PCR擴增（以上Outer Primer和Inner Primer均由TaKaRa公司試劑盒提供）。反應程序同3' RACE。

1.2.6 克隆及測序 RT-PCR和3'/5'端RACE-PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的條帶經(jīng)DNA片段凝膠回收試劑盒（北京三博遠志）純化、回收后，連接到pMD19-T載體（TaKaRa）上，并轉化到大腸桿菌DH5α中。轉化后生成的菌落，通過藍白斑篩選，隨機選取3個陽性單克隆，交由上海鉑尚生物技術有限公司進行雙向測序。

1.2.7 生物信息學及系統(tǒng)進化分析 測序結果經(jīng)Lasergene［18］軟件校對、拼接獲得cDNA序列全長。使用NCBI中的ORFfinder程序進行開放閱讀框（ORF）及基因兩端非編碼區(qū)預測并推導出相應的氨基酸序列。運用BioEdit［19］進行多重序列比對，尋找PIWI結構域活性催化模體。蛋白質(zhì)的理論分子量、等電點及其它基本性質(zhì)的分析采用Prot Param［20］進行，二、三級結構分別通過PROSITE［21］和Phyre2［22］軟件進行預測。采用 MEGA5［23］軟件基于鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果

2.1 cDNA全長序列分析

將測序所得序列片段進行剪接，得到全長3 462bp的cDNA序列，GenBank序列登錄號為JX998175。該序列包含2 742bp的開放閱讀框，共編碼913個氨基酸殘基，5'非編碼區(qū)（5' UTR）111bp和3'非編碼區(qū)（3' UTR）609bp。預測的理論蛋白分子量為102.7kD，等電點為9.55。Giwi蛋白具備Piwi蛋白亞家族全部特征，C端的保守PIWI結構域，中部的保守PAZ結構域和N端可變結構域（圖 1）。

2.2 序列比對及系統(tǒng)進化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取具有代表性的脊椎動物和截止2012年10月10日登錄的全部昆蟲Piwi蛋白亞家族序列，包括：斑馬魚Danio rerio（NP_89918-1.1、ABM46842.2）、 人 Homo sapiens（AAC97371.2、AAK92281.1、BAC81341.1、BAC81343.1、BAC813-42.1）、 小 鼠 Musmusculus（BAA93706.1、ABM691-81.1、AAN75583.1）、大鼠 Rattus norvegicus（NP_00-1102323.1）、埃及伊蚊 Aedes aegypti（XP_0016576-26.1、XP_001652831.1、XP_001652945.1、XP_0016-53082.1、XP_001663408.1、XP_001663409.1、XP_-001663870.1）、切葉蟻 Acromyrmex echinatior（EGI6-4222.1）、 意 大 利 蜜 蜂 Apismellifera（ACV84372.1、NP_001159378.1）、家蠶 Bombyxmori（NP_0010980-67.2、NP_001098066.2、BAF73718.2）、弓背蟻Camponotus floridanus（EFN67778.1）、致倦庫蚊 Culex quinquefasciatus（XP_001867947.1、XP_001844024.1、XP_001844067.1、XP_001844068.1、XP_0018470-30.1、XP_001860347.1、XP_001862491.1、XP_001-867946.1）、黑腹果蠅 Drosophilamelanogaster（ABO-26294.1、ABO27430.1、AAD38655.1、AAD08705.1、NP_476875.1）、大紅斑蝶 Danaus plexippus（EHJ69-790.1、EHJ75824.1）、印度跳蟻Harpegnathos saltator（EFN77932.1、EFN83189.1）、褐飛虱Nilaparvata lugens（AEI25513.1）、人虱 Pediculushumanus corporis（XP_002431988.1）、 赤 擬 谷 盜 Tribolium castaneum（EFA-02921.1、EFA07425.1）和優(yōu)雅蟈螽Gampsocleis gratiosa共47條。運用BioEdit進行多重序列比對分析，得出PIWI結構域亦具有類似RNA酶H活性中心的DDH（Asp/Asp/His）三聯(lián)催化模體（圖1），3D模型中可見PAZ結構域圍成的袋狀結構，DDH催化位點深埋袋中（圖2）。

圖1 優(yōu)雅蟈螽giwi基因 cDNA核苷酸序列和氨基酸序列

用黑腹果蠅Drosophilamelanogaster Ago1（NP_725341.1）蛋白序列作為外群，采用NJ法構建分子進化樹。結果（圖3）顯示，Piwi蛋白亞家族聚類形成兩個大的分枝A和B。分枝A，由28條昆蟲Piwi和Aubergine蛋白組成，雖然又可進一步劃分為兩個較小的分枝I和Ⅱ，但是這兩個分枝與Piwi和Aubergine蛋白并不對應。例如：果蠅的Piwi和Aubergine蛋白都位于分枝I，而家蠶的Piwi和Aubergine蛋白，及本研究所獲得Giwi蛋白均位于分枝Ⅱ。分枝B，由7條昆蟲的Ago3、2條昆蟲的Piwi蛋白及11條脊椎動物的Piwi蛋白組成，可進一步劃分為3個較小的分枝III、IV和V。分枝III和IV分別由8條和3條脊椎動物的Piwi蛋白構成；分枝V則由昆蟲的Ago3和2條昆蟲Piwi蛋白構成，且與分枝IV形成姊妹群。

圖2 優(yōu)雅蟈螽Giwi預測蛋白的3D結構

3 討論

本研究預測所得Giwi蛋白為Piwi蛋白亞家族成員。該家族蛋白進化保守，均含有C端的PIWI結構域，中部的PAZ結構域和N端的可變結構域［24］。PAZ結構域是小RNA結合區(qū)域，PIWI結構域具有類似RNA酶H的DDH三聯(lián)催化模體，是行使切割功能的活性中心，與piRNAs的生成有密切關系［24，25］。通常認為含有活性DDH三聯(lián)催化模體的Piwi蛋白具有剪切活性或類剪切活性［24］。Giwi蛋白亦含有DDH三聯(lián)結構，暗示該蛋白具有切割活性。

Piwi蛋白亞家族偏好表達于生殖系細胞，對生殖干細胞的自我更新和生殖系發(fā)育起著重要的調(diào)控作用［2，26］。該亞家族根據(jù)果蠅Piwi蛋白成員被分為三類 ：Piwi、Aubergine和 Ago3［27］。然而，本研究系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，昆蟲的Piwi和Aubergine在進化樹上位于相同的枝上，果蠅和家蠶的Piwi和Aubergine蛋白都沒有按照物種差異區(qū)分開來。有報道推測piwi和aubergine基因可能來源于遠古基因的重復事件［24］。脊椎動物的Piwi蛋白和昆蟲的Ago3蛋白在進化樹上亦沒有明顯的分開，Ⅴ號進化枝上的2個昆蟲Piwi蛋白指出該蛋白亞家族在命名過程中可能存在問題，以上問題有待進一步的研究來加以闡明。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，關于未知新基因的cDNA全長的獲得方法日新月異，包括基于構建cDNA文庫法、基于通用簡并引物的RT-PCR法和計算機基因克隆法，又稱硅片克隆、電子克?。?8］。構建cDNA文庫工作量較大，獲得的序列片段長度有限，且文庫覆蓋范圍有限［29］。通用簡并引物PCR法是根據(jù)數(shù)據(jù)庫中已有物種序列設計簡并引物進行擴增，方便簡單，但是由于個體內(nèi)通常存在同一基因家族的多個成員，而這些簡并引物在基因上的位置又經(jīng)常位于該基因家族的結構域，因此，所獲得的測序結果往往是該基因家族的其他成員［30］。電子克隆依靠電腦和網(wǎng)絡資源，速度快、成本低是其最大的優(yōu)點，但電子克隆可依賴的EST序列有限，而且這些序列由于測序豐度的限制，有些序列甚至僅僅是單次測序結果，其精確性有待驗證［31］。本研究則在基于454高通量測序獲得的轉錄組序列的基礎上，篩選感興趣的目的功能基因，通過RT-PCR和RACE末端擴增技術克隆獲得該基因的cDNA序列全長。隨著高通量測序平臺的市場化，轉錄組測序成本的進一步降低，轉錄組測序的研究方法在分子生物學相關研究領域的應用會更加廣泛。

4 結論

本研究以半變態(tài)昆蟲優(yōu)雅蟈螽為材料，通過對二代測序獲得的轉錄組數(shù)據(jù)進行搜索，成功挑選出piwi基因的同源體并對其進行研究，得到giwi cDNA序列全長。序列分析預測所得Giwi蛋白具備Piwi蛋白亞家族全部特征。同源比對分析得到PIWI結構域具有類似RNA酶H活性中心的DDH三聯(lián)催化模體。系統(tǒng)發(fā)育分析指出昆蟲的Piwi和Aubergine可能源于遠古基因的重復事件，Piwi蛋白亞家族在命名過程中可能存在問題，以上問題有待進一步研究。

圖3 優(yōu)雅蟈螽及其他Piwi亞家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

［1］ 馮振月, 潘敏慧, 魯成.果蠅生殖腺干細胞和它們的微環(huán)境［J］.細胞生物學雜志, 2006, 28：169-172.

［2］ Lin H, Spradling AC.A novel group of pumiliomutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary［J］.Development, 1997, 124（12）：2463-2476.

［3］ Cox DN, Chao A, Baker J, et al.A novel class of evolutionarily conserved genes defined by piwi are essential for stem cell selfrenewal ［J］.Genes Dev, 1998, 12（23）：3715-3727.

［4］ Cox DN, Chao A, Lin H.piwi encodes a nucleoplasmic factor whose activitymodulates the number and division rate of germline stem cells ［J］.Development, 2000, 127（3）：503-514.

［5］ Lu J, Clark AG.Population dynamics of PIWI-interacting RNAs（piRNAs）and their targets in Drosophila ［J］.Genome Res, 2010,20（2）：212-227.

［6］ Frost RJ, Hamra FK, Richardson JA, et al.MOV10L1 is necessary for protection of spermatocytes against retrotransposons by Piwiinteracting RNAs ［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107（26）：11847-11852.

［7］ Siomi MC, Mannen T, Siomi H.How does the Royal Family of Tudor rule the Piwi-interacting RNA pathway? ［J］.Genes Dev, 2010, 24（7）：636-646.

［8］ Kuramochi-Miyagawa S, Kimura T, Yomogida K, et al.Twomouse piwi-related genes：miwi andmili ［J］.Mech Dev, 2001, 108（1-2）：121-133.

［9］ Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, et al.An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans ［J］.Science, 2001, 294（5543）：858-862.

［10］ Qiao D, Zeeman AM, Deng W, et al.Molecular characterization ofhiwi, ahumanmember of the piwi gene family whose overexpression is correlated to seminomas ［J］.Oncogene, 2002, 21（25）：3988-3999.

［11］ Tan CH, Lee TC, Weeraratne SD, et al.Ziwi, the zebrafishhomologue of the Drosophila piwi：Co-localization with vasa at the embryonic genital ridge and gonad-specific expression in the adults［J］.Mech Dev, 2002, 119（Suppl 1）：221-224.

［12］ Houwing S, Kamminga LM, Berezikov E, et al.A role for Piwi and piRNAs in germ cellmaintenance and transposon silencing in zebrafish ［J］.Cell, 2007, 129（1）：69-82.

［13］ Kawaoka S, Minami K, Katsuma S, et al.Developmentally synchronized expression of two Bombyxmori Piwi subfamily genes,SIWI and BmAGO3 in germ-line cells ［J］.Biochem Biophys Res Commun, 2008, 367（4）：755-760.

［14］ Liao Z, Jia Q, Li F, et al.Identification of two PIWI genes and their expression profile inhoneybee, Apismellifera ［J］.Arch Insect Biochem Physiol, 2010, 74（2）：91-102.

［15］ Li L, Xie T.Stem cell niche：structure and function ［J］.Annu Rev Cell Dev Biol, 2005, 21：605-631.

［16］ Nation JL.Insect physiology and biochemistry ［M］.Boca Raton：CRC Press, 2002：1-544.

［17］ Singh VK, Mangalam AK, Dwivedi S, et al.Primer premier：program for design of degenerate primers from a protein sequence［J］.BioTechniques, 1998, 24（2）：318-319.

［18］ Burland TG.DNASTAR's Lasergene sequence analysis software［J］.Methods Mol Biol, 2000, 132：71-91.

［19］ Thomas AH.BioEdit：a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT ［J］.Nucleic Acids Symposoum Series, 1999（41）：95-98.

［20］ Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, et al.Protein identification and analysis tools on the ExPASy server［M］//Walker JM.The Proteomics Protocols Handbook.Totowa：Humana Press, 2005：571-607.

［21］ Castro Ed, Sigrist CJA, Gattiker A, et al.ScanProsite：Detection of PROSITE signaturematches and ProRule-associated functional and structural residues in proteins ［J］.Nucleic Acids Research, 2006,34：362-365.

［22］ Kelley LA, Sternberg MJE.Protein structure prediction on the Web：a case study using the Phyre server ［J］.Nature Protocols 2009, 4（3）：363-371.

［23］ Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis usingmaximum likelihood,evolutionary distance, andmaximum parsimonymethods ［J］.Mol Biol Evol, 2011, 28（10）：2731-2739.

［24］ Zhou X, Liao Z, Jia Q, et al.Identification and characterization of Piwi subfamily in insects ［J］.Biochem Biophys Res Commun,2007, 362（1）：126-131.

［25］ 李超, 杜志游, 陳集雙.解讀 AGO蛋白結構及其功能［J］.中國生物化學與分子生物學報, 2009, 25（11）：969-976.

［26］ Thomson T, Lin H.The biogenesis and function of PIWI proteins and piRNAs：progress and prospect ［J］.Annu Rev Cell Dev Biol, 2009, 25：355-376.

［27］ Samji T.PIWI, piRNAs, and Germline Stem Cells：What’s the link? ［J］.Yale Journal of Biology And Medicine, 2009, 82（2009）：121-124.

［28］ 樊紅, 李鈺.克隆新基因cDNA全長的策略和方法［J］.國外醫(yī)學遺傳學分冊, 2002, 25（1）：11-13.

［29］ 晏慧君, 黃興奇, 程在全.cDNA文庫構建策略及其分析研究進展［J］.云南農(nóng)業(yè)大學學報, 2006, 21（1）：1-6.

［30］ 曹存巍, 劉偉, 李若瑜.簡并PCR結合RACE技術克隆馬爾尼菲青霉素未知基因［J］.中國皮膚性病學雜志, 2007, 21（11）：660-662.

［31］ 胡皝, 蕭浪濤.生物信息學在新基因全長cDNA電子克隆中的應用［J］.生物技術通報, 2007（4）：93-96.