李曉梅 王閔霞 秦廷豪 陽翠 安琪 張軍

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是重要的糖能經(jīng)濟(jì)作物，在世界各地廣泛栽植，其產(chǎn)糖量約占世界糖產(chǎn)量的60％- 70％［1］，在我國(guó)則占到90％以上［2］。甘蔗大田生產(chǎn)的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期內(nèi)均會(huì)受到多種蟲害威脅，尤以鱗翅目害蟲——蔗螟（主要有條螟、二點(diǎn)螟、大螟、白螟及黃螟等）危害最大，以幼蟲蛀入甘蔗幼苗和蔗莖，導(dǎo)致甘蔗商品性、糖分等品質(zhì)下降，并帶來每年20％-25％的損失［3］。利用有性雜交技術(shù)培育抗蟲甘蔗品種是提高甘蔗抗蟲能力的重要途徑［4］。但是，甘蔗是高度雜合的異源多倍體和多倍的非整倍體植物，遺傳背景復(fù)雜，利用傳統(tǒng)育種方法從有性雜交到良種育成要10-13年，周期長(zhǎng)，成效低［5，6］。基因工程可以定向改變作物的某些性狀，為植物育種開辟了新途徑。

Arencibia等、Enriquez-Obreqon等和Elliott等［7-9］于1998年分別通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地實(shí)現(xiàn)了甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化，開辟了甘蔗農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因研究的先河。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法簡(jiǎn)便、易于操作，克服了基因槍法及電擊法等直接轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率低，轉(zhuǎn)化體嵌合體多、轉(zhuǎn)化外植體不易成活及拷貝數(shù)多的缺點(diǎn)，所以研究甘蔗根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)甘蔗遺傳工程改良有理論及實(shí)踐意義。

Bt基因是從微生物蘇云金桿菌分離出的一種殺蟲結(jié)晶蛋白基因，是一種廣譜性的抗蟲基因，它指導(dǎo)合成的殺蟲結(jié)晶蛋白（ICP）對(duì)許多鱗翅目、雙翅目及鞘翅目的昆蟲均有較強(qiáng)毒性。至1987年首次獲得轉(zhuǎn)Bt煙草植株以來，現(xiàn)已在許多植物的遺傳轉(zhuǎn)化中得以運(yùn)用［10］。本研究旨在利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt（cry1Ab）基因?qū)胱杂收崞贩N“川蔗23號(hào)”中，實(shí)現(xiàn)其抗蟲性改良。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蔗材料為“川蔗23號(hào)”，由四川省植物工程研究院糖料作物研究所選育，于2011年11月至2012年2月取自研究院內(nèi)試驗(yàn)場(chǎng)，每次取10個(gè)蔗鞘。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物與核技術(shù)研究所提供，具有卡那霉素及利福平抗性。質(zhì)粒為pCAMBIA1301-Cry1Ab，攜帶潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Hpt），以玉米的Ubi-1為啟動(dòng)子。

1.1.3 試劑 卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、羧芐青霉素（Car）、乙酰丁香酮（AS）和潮霉素（Hyg）均為Sigma公司產(chǎn)品，Taq DNA聚合酶、dNTP為上海生工產(chǎn)品，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基 甘蔗植株再生及遺傳轉(zhuǎn)化各個(gè)階段的最佳培養(yǎng)基，見表1。

表1 甘蔗再生體系建立及遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成

1.2 方法

1.2.1 胚性愈傷的誘導(dǎo)及再生體系的建立 以川蔗23號(hào)的幼嫩葉鞘為外植體，經(jīng)常規(guī)滅菌后切成厚度為0.3cm左右的幼葉卷，接種于M1上，25℃黑暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚性愈傷組織。胚性愈傷轉(zhuǎn)入M2上，25℃，1500lx下分化培養(yǎng)，當(dāng)分化苗約5cm時(shí)將其轉(zhuǎn)入M3中生根培養(yǎng)，20d后進(jìn)行煉苗假植，移栽至含有蛭石∶草炭=1∶1的盆缽內(nèi)，成活后移栽入大田。

1.2.2 潮霉素抗性濃度的篩選試驗(yàn) 將胚性愈傷組織和叢芽分別轉(zhuǎn)入添加不同濃度Hyg（0、10、20、30、40和50mg/L）的M1、M2、M3上，觀察愈傷生長(zhǎng)、叢芽分化及生根情況，確定甘蔗不同分化階段最佳潮霉素篩選濃度。

1.2.3 農(nóng)桿菌工程菌液的制備 從M4上挑取單菌落于新鮮的M4上劃線培養(yǎng)，48-72h后刮取長(zhǎng)0.5-1.0cm的菌體，懸浮于M5內(nèi)，其OD600為0.1左右［11］，再置于28℃，180r/min條件下振蕩培養(yǎng)2h，以誘導(dǎo)農(nóng)桿菌vir基因的活化表達(dá)，此菌液即為轉(zhuǎn)化工程菌液。

1.2.4 胚性愈傷的預(yù)培養(yǎng)及預(yù)處理 胚性愈傷組織置于培養(yǎng)基M1上預(yù)培養(yǎng)4d，轉(zhuǎn)化前于超凈工作臺(tái)吹風(fēng)處理45min左右，讓其微微干縮，以待用。

1.2.5 甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化 將預(yù)處理的胚性愈傷浸沒于工程菌液中感染1.5min［11］，轉(zhuǎn)到濾紙上吸干多余菌液，然后接種到M6上，23℃黑暗共培養(yǎng)3-4d。用無菌水清洗至無渾濁后，用含有Car 500mg/L的無菌水浸泡2min，再用無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干后，接種于M7上，25℃黑暗培養(yǎng)14d，轉(zhuǎn)入M8中25℃，1500 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)以誘導(dǎo)芽的形成，當(dāng)抗性芽長(zhǎng)至5cm左右時(shí)，轉(zhuǎn)入M9中以篩選抗性完整植株。為篩選適宜于甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化的愈傷年齡，分別用接種后20、30、40和50d的愈傷為受體，每個(gè)處理20個(gè)外植體，重復(fù)3次，經(jīng) 20mg/L潮霉素抗性篩選20d后，以抗性愈傷百分率的高低評(píng)判胚性愈傷的優(yōu)劣。

抗性愈傷率（％）=抗性愈傷組織塊數(shù)/接入愈傷組織塊數(shù)×100％

1.2.6 抗性植株的PCR檢測(cè) 采用改良CTAB法提取植株葉片的總DNA，根據(jù)Bt（Cry1Ab）中間序列合成反應(yīng)引物5' -TCATCCAGCGAATCTACC-3'和5'-AACAGTGCCCTTACAACC-3'，目的片段大小為823bp（由上海生工合成）。分別以潮霉素抗性植株的DNA、對(duì)照甘蔗植株的DNA及質(zhì)粒DNA為模板，用合成引物，在49℃退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 甘蔗胚性愈傷的誘導(dǎo)及不定芽的再生

切取的幼葉卷在M1上培養(yǎng)大約3-5d 后開始膨大，并從葉卷中心開始凸起，愈傷組織最開始從葉卷內(nèi)部及葉卷邊緣開始形成（圖1-A）。培養(yǎng)25d后外植體整個(gè)形成疏松、黃色、水分含量較多的愈傷組織，并在其上有零星團(tuán)狀白色、致密、顆粒狀的愈傷形成，此類愈傷組織即為胚性愈傷組織。它們除了具有分生能力強(qiáng)、易于再生等特性外，還有與胚細(xì)胞相似的接受T-DNA的能力。為使侵染材料胚性一致，將誘導(dǎo)的少量胚性愈傷進(jìn)行繼代培養(yǎng)，2周后即可作為浸染材料（圖1-B）。胚性愈傷組織分化能力極強(qiáng)，在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后7d左右就有綠色芽點(diǎn)形成，約2周后即長(zhǎng)至2cm長(zhǎng)，由于胚狀體是由單細(xì)胞發(fā)育而來，因此胚性愈傷團(tuán)發(fā)育形成芽叢，不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后都能達(dá)到100％的生根率，并且在主芽周圍還能分蘗形成許多側(cè)芽（圖1-C）。

在研究中發(fā)現(xiàn)甘蔗外植體極易褐化，在切取外植體的過程中其傷口隨即變?yōu)楹稚?，在培養(yǎng)過程中約有15％的外植體不能產(chǎn)生愈傷組織而褐化、死亡，有些外植體在形成愈傷組織后也極易褐化。研究發(fā)現(xiàn)通過添加50mg/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可有效減輕愈傷組織在培養(yǎng)過程中的褐化（圖2），但對(duì)不能形成愈傷組織的外植體無效。

圖1 甘蔗再生體系的建立

圖2 添加50mg/LPVP對(duì)愈傷褐化的抑制作用

2.2 潮霉素濃度對(duì)胚性愈傷增殖、分化及叢芽生根的影響

潮霉素抗性濃度篩選預(yù)試驗(yàn)表明，隨著潮霉素濃度的增加胚性愈傷增殖率、分化率及生根率都逐漸下降（表2）。當(dāng)潮霉素濃達(dá)20mg/L時(shí)甘蔗胚性愈傷分化率僅為11％，并且分化的不定芽不能伸長(zhǎng)，約10d后黃化死亡（圖3-A）。由于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的死亡會(huì)影響周圍轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)，為保證轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)，在前期篩選階段選擇較低濃度的潮霉素（20mg/L）。甘蔗小芽對(duì)潮霉素的耐受性稍大于胚性愈傷，在10mg/L濃度下其生根率達(dá)到100％，只是再生的根與對(duì)照相比較少、較纖弱并且顏色為褐色（圖3-B），在20mg/L濃度下其生根率為38.9％，形成的根較短色澤較深，上部芽部分黃化，約40d后植株整體死亡。在30mg/L時(shí)，其芽叢不能生根，并且20d后全部褐化死亡。為防止假陽性植株的逃逸，其生根篩選壓以30mg/L為宜。

表2 潮霉素濃度對(duì)愈傷組織增殖、分化及不定芽生根的影響

圖3 潮霉素對(duì)胚性愈傷再生及不定芽生根的篩選作用

2.3 甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株的獲得

2.3.1 轉(zhuǎn)化用適齡愈傷組織篩選 受體材料的生理狀況及胚性的一致性是轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。以外植體接種后20、30、40和50d的愈傷組織作為起始材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，經(jīng)20mg/L潮霉素連續(xù)篩選20d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）表明，當(dāng)愈傷齡期在40d以前，抗性愈傷率隨著齡期增加而增加，超過40d則顯著降低，因此培養(yǎng)40d的愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體適齡愈傷組織。

表3 不同齡期愈傷組織經(jīng)20mg/L潮霉素篩選后抗性愈傷率

2.3.2 抗性植株的獲得 以培養(yǎng)40d胚性一致，大小為0.3-0.5cm的愈傷組織塊為受體材料，用OD600值為0.1左右的工程菌液浸染1.5min，經(jīng)抗性愈傷篩選后的胚性愈傷在分化篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)40d左右即可分化出小苗（圖4-A）。本研究共進(jìn)行了4批次的重復(fù)試驗(yàn)，侵染愈傷組織764塊，最終獲得98塊抗性愈傷，轉(zhuǎn)入M8后40d分化出31個(gè)抗性植株（系），將抗性株系分株轉(zhuǎn)入M9中，共有65個(gè)單株生根，經(jīng)PCR檢測(cè)后有2株擴(kuò)增到目的條帶（圖4-B），擴(kuò)增到目的條帶的兩株植株相對(duì)于其他植株生長(zhǎng)較弱，只有12個(gè)分蘗（圖4-C），但陽性植株轉(zhuǎn)入大田栽培后，其長(zhǎng)勢(shì)與分蘗能力與對(duì)照無差異（圖4-D），陽性植株等待進(jìn)一步的Dot-Southern檢測(cè)及田間抗蟲性驗(yàn)證。

圖4 甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化與檢測(cè)

3 討論

外植體褐變是植物組織培養(yǎng)的三大技術(shù)難點(diǎn)之一，也是甘蔗組織培養(yǎng)的主要技術(shù)難點(diǎn)。在甘蔗中含有較多的酚類物質(zhì)，這些物質(zhì)極易氧化成褐色的醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)在酪氨酶等的作用下，使外植體細(xì)胞中的蛋白質(zhì)聚合，生長(zhǎng)停頓，最終導(dǎo)致死亡。在不同生長(zhǎng)季節(jié)，甘蔗植株體內(nèi)酚類化合物含量和多酚氧化酶的活性不相同。一般在夏、冬季節(jié)酚類物質(zhì)含量和多酚氧化酶活性有所提高，此時(shí)外植體的褐化率較高［12］。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)“川蔗23號(hào)”甘蔗幼葉卷外植體褐化率高達(dá)15％左右，這些外植體未膨大，仍保持接種時(shí)的狀態(tài)即完全褐化，在形成愈傷后其愈傷褐化率逐漸降低，可能是因?yàn)槿〔臅r(shí)間在冬季的原因。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，可用于防止褐變。本研究發(fā)現(xiàn)添加50mg/L PVP可有效降低培養(yǎng)中愈傷組織的褐化率，但對(duì)于未形成愈傷即褐變的外植體效果不明顯。

潮霉素是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中應(yīng)用較多的抗生素之一。本研究發(fā)現(xiàn)甘蔗在愈傷組織分化與再生苗生根階段對(duì)潮霉素較敏感，其最佳篩選濃度分別為20mg/L、30mg/L，這與陳麗新等［13］的研究結(jié)果相似。

選用適宜的受體材料是轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)25d后的外植體上形成的愈傷主要為非胚性愈傷，其上只有零星的胚性愈傷顆粒，40d齡期的愈傷組織胚性較一致且大小適宜，經(jīng)潮霉素篩選后抗性愈傷率較高；當(dāng)愈傷齡期超過40d后，愈傷組織容易褐化并產(chǎn)生黏性物質(zhì)，并且有部分愈傷即使在黑暗培養(yǎng)條件下也會(huì)開始逐漸分化，不利受體的遺傳轉(zhuǎn)化。而羅敬萍等［14］研究表明培養(yǎng)25d的甘蔗愈傷組織胚性較好，為最適轉(zhuǎn)化受體。這可能與甘蔗品種及取材時(shí)間有關(guān)，不同品種及取材時(shí)間其外植體活性不同，達(dá)到一致胚性狀態(tài)的時(shí)間不同。

在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化中工程菌液的濃度與侵染時(shí)間是影響轉(zhuǎn)化率的重要因素。在預(yù)試驗(yàn)階段采用王自章等、唐建平等［15，16］遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗中使用的農(nóng)桿菌菌液濃度與侵染時(shí)間進(jìn)行“川蔗23號(hào)”的遺傳轉(zhuǎn)化，但均因在篩選培養(yǎng)階段農(nóng)桿菌的過度增殖導(dǎo)致胚性愈傷缺氧而褐化、死亡，未能獲得抗性植株。日本研究者Nishimura等［11］在水稻農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化中的研究發(fā)現(xiàn)較低的農(nóng)桿菌侵染濃度與較短的侵染時(shí)間也可高效的遺傳轉(zhuǎn)化水稻。因此，在后續(xù)的試驗(yàn)中采用Nishimura等用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用較低的根癌農(nóng)桿菌侵染濃度與較短的侵染時(shí)間處理后的甘蔗胚性愈傷在共培養(yǎng)3d后也會(huì)有可見的菌體出現(xiàn)，在脫菌中用含有500mg/L Car的無菌水中浸泡2min再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中即可很好的抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。

至1987年Chen等［17］首次開展甘蔗轉(zhuǎn)基因以來，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者成功應(yīng)用基因槍法、電擊法及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將多種外緣基因（如抗病性基因SCMV-CP、抗蟲基因Bt、抗除草劑基因Bar、開花啟動(dòng)基因Leafy、抗旱基因Tsase等）轉(zhuǎn)入甘蔗中［18，19］。但相對(duì)于水稻、小麥、玉米等單子葉植物來說，甘蔗轉(zhuǎn)基因技術(shù)相對(duì)滯后，開展或利用有效的轉(zhuǎn)基因方法，如利用雙元或多元載體系統(tǒng)，建立高效表達(dá)的受體系統(tǒng)，構(gòu)建適合甘蔗的特異啟動(dòng)子，加強(qiáng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的研究及功能基因的分離將是今后甘蔗轉(zhuǎn)基因研究的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究以“川蔗23號(hào)”幼嫩葉鞘為外植體，以超毒菌株EHA105為轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株，Hpt基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，Ubi為啟動(dòng)子，以40d胚性愈傷為受體材料，首次在甘蔗上采用低濃度的農(nóng)桿菌（OD600=0.1左右）和較短的侵染時(shí)間（1.5min），成功實(shí)現(xiàn)了甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化Bt（cry1Ab）基因。

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