湯京龍 王 碩 劉 麗 王春仁 奚廷斐

(1中國食品藥品檢定研究院，北京，100050)

(2北京大學(xué)深圳研究院，深圳 518055)

因為具有比傳統(tǒng)抗菌劑更優(yōu)的抗菌效果，納米銀已在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[1-2]。現(xiàn)在臨床使用的納米銀醫(yī)用產(chǎn)品主要包括婦科用的納米銀凝膠、納米銀敷料、納米銀醫(yī)用導(dǎo)管等幾種[3-5]。據(jù)不完全統(tǒng)計，國內(nèi)已有20多家企業(yè)生產(chǎn)的納米銀產(chǎn)品應(yīng)用于臨床，在中國使用范圍已遍布20多個省、直轄市和自治區(qū)。

但是近年來國內(nèi)外的研究顯示，納米銀顆粒具有在體內(nèi)遷移的特性，能夠以顆粒狀形態(tài)進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)并在體內(nèi)遷移、分布，最終以顆粒狀形態(tài)蓄積在肝、腎、脾、腦、肺等器官中，在某些情況下還能引起這些器官發(fā)生毒性反應(yīng)[6-8]。特別是發(fā)現(xiàn)納米銀顆?？梢允寡X屏障(blood-brain barrier，BBB)發(fā)生異常，并通過血腦屏障進(jìn)入腦部，使部分腦神經(jīng)元細(xì)胞變性[9]。但是，現(xiàn)有研究還無法說明納米銀顆粒通過血腦屏障機(jī)理。本研究中由納米銀顆粒通過血腦屏障的劑量-效應(yīng)關(guān)系的研究，來初步推測納米銀顆粒通過血腦屏障的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中采用的納米銀顆粒和微米銀顆粒，和Tang等的文獻(xiàn)報告相同[10]。納米銀顆粒(Sigma，產(chǎn)品號為576832)是粒徑在10～100 nm范圍內(nèi)的球形顆粒，微米銀顆粒(Sigma，產(chǎn)品號為327107)是粒徑范圍在2～20μm之間的含有不規(guī)則鈍角的立方體。

1.2 體外血腦屏障模型的建立

本研究中根據(jù)Tang等在文獻(xiàn)[11]中的報告，建立體外血腦屏障模型。首先在體外分別培養(yǎng)大鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 (brain microvessel vascular endothelial cells，BMVECs)和大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes，ACs)；然后將培養(yǎng)好的兩種細(xì)胞分別種植于多孔底碟(transwell)上聚碳酸酯微孔膜的兩側(cè)；最后將種植兩種細(xì)胞的transwell放入細(xì)胞培養(yǎng)池中培養(yǎng)，直至測試跨腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞電阻值大于等于400Ω·cm-2時，建立的模型可供下一步試驗使用。

這個體外BBB模型的特點是：在transwell上聚碳酸酯膜的上表面形成一層均勻的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞單層；下表面星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起可穿過膜孔與腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞相接觸，比較近似的模擬出體內(nèi)BBB結(jié)構(gòu)；這個transwell上的細(xì)胞模型能夠?qū)⑴囵B(yǎng)池分為供池和受池兩部分；供池代表腦毛細(xì)血管腔；受池代表的是血腦屏障外的腦部(圖1)。

1.3 納米銀顆粒通過血腦屏障的劑量-效應(yīng)關(guān)系

1．3．1 試驗分組

試驗分為3組，分為對照組、納米銀組(劑量分別為 25，50，100，200，400 μg·mL-1)和微米銀組(劑量 分別 為 100，400 μg·mL-1)， 其 中 對 照 組 采用DMEM 培 養(yǎng) 液 (Dulbecco′s modification of Eagle′s medium Dulbecco)作為試驗樣品，納米銀組采用納米銀顆粒/DMEM混懸液作為試樣，微米銀組采用微米銀顆粒/DMEM混懸液作為試樣。

1．3．2 試驗方法

1．3．2．1 模型的建立及樣品的加入

參照1．2的方法，建立試驗用體外BBB模型。將各組樣品加入到已通過驗證的完整的BBB體外模型的供池中共同培養(yǎng)，每孔2 mL，靜置4 h。以上試驗平行進(jìn)行5組。

1．3．2．2 銀含量的測定

4 h后，停止反應(yīng)，由平行進(jìn)行5組試驗中隨機(jī)取4組，從各自的BBB模型中收集樣品。包括(1)取出所有樣品供池中的培養(yǎng)液，此部分樣品不用被棄除；(2)取出多孔底碟(Transwell)，將碟上聚碳酸酯膜(包括吸附在膜上的BMVECs和ACs)切下，用雙蒸水洗滌2～3次，將附在BMVECs和ACs表面的銀顆粒洗掉 (這部分銀顆粒是反應(yīng)過程中因重力沉降在細(xì)胞表面的銀顆粒)，收集備用；(3)再收集各樣品受池中的全部培養(yǎng)液。

向收集的各樣品中加入5 m L濃硝酸 (ρ＝1．42 g·mL-1，優(yōu)級純)，消解定容。 在 ICP-MS上測定各樣品在定容液中的銀濃度(ppt)，并計算得到各樣品中銀質(zhì)量(μg)，再分別換算成其所占加入的銀總量的百分比。

各組試驗的結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，SPSS12．0進(jìn)行處理，各試驗組之間相同位置(BBB細(xì)胞內(nèi)或受池內(nèi))銀含量數(shù)據(jù)用單因素方差分析，LSD法做均數(shù)的多重兩兩比較，p＜0．05為顯著性差異。

1．3．2．3 血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的觀察

將1．3．2．2剩余的一組試驗樣品的聚碳酸酯多孔膜切下，用 2．5%多聚甲醛-2．5%戊二醛，4 ℃固定 1．5～2 h，按文獻(xiàn)[7]制備超薄切片，在透射電鏡(H-7650°日立透射電子顯微鏡，日立高新技術(shù)(上海)國際貿(mào)易有限公司)上觀察腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞間緊密連接的狀態(tài)，放大倍數(shù)為1萬倍至12萬倍。

2 結(jié) 果

2.1 血腦屏障中銀通過率的測定

各試驗組受池中銀含量的測試結(jié)果列于表1。這一部分的銀代表的是已通過血腦屏障的銀。

表1 受池中銀含量數(shù)據(jù)Table 1 Silver content in acceptor champer

首先根據(jù)表1的結(jié)果比較相同劑量下納米銀組和微米銀組通過BBB模型的銀含量的差別，結(jié)果顯示，納米銀組通過血腦屏障的銀顯著高于微米銀組(圖2)，而微米銀組與對照組之間無顯著性差異。

然后再進(jìn)一步比較不同劑量的納米銀通過血腦屏障的銀含量之間的差異，圖3顯示了通過血腦屏障的銀含量隨納米銀劑量變化的曲線。由圖可以看出，當(dāng)納米銀劑量小于100μg·mL-1時，通過BBB的納米銀百分比變化不大，基本維持在2%左右。但當(dāng)納米銀劑量達(dá)到100μg·mL-1后，隨著納米銀劑量的增加，通過BBB的納米銀百分比也不斷增大，當(dāng)劑量達(dá)到400μg·mL-1時，已有約15%的納米銀通過了血腦屏障。

2.2 體外BBB模型超微結(jié)構(gòu)的觀察

圖4顯示了對照組和微米銀組血腦屏障模型的超微結(jié)構(gòu)照片，由圖可以看出，兩組血腦屏障模型中，構(gòu)成主要屏障功能的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接結(jié)構(gòu)完整、連接緊密，這顯示微米銀的加入并沒有破壞血腦屏障。

圖5顯示了不同劑量下納米銀對血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的影響。當(dāng)劑量較低時(25μg·mL-1)，和微米銀組、對照組相似，構(gòu)成主要屏障功能的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接結(jié)構(gòu)完整、連接緊密(圖5a)；但和其它兩組不同的是，在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有外源性類圓形顆粒，直徑與所使用的納米銀顆粒相近(圖5b)，而這在對照組和微米銀組內(nèi)皮細(xì)胞中均未有發(fā)現(xiàn)，推測是納米銀顆粒進(jìn)入了內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)部。當(dāng)劑量增加到100μg·ml-1后，BMVECs間的緊密連接依然緊密，但發(fā)現(xiàn)部分內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生變性，出現(xiàn)壞死跡象，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)一些空泡，顯示有細(xì)胞器壞死(圖5c)，在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有外源性類圓形顆粒，直徑與所使用的納米銀顆粒相近(圖5d)，推測是納米銀顆粒進(jìn)入了內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)部。隨著劑量進(jìn)一步增大 (200μg·mL-1)，可以看出血腦屏障中，大量的BMVECs壞死，BMVECs間的緊密連接明顯被破壞，出現(xiàn)了較大的空隙 (圖5e)。當(dāng)劑量增大到400μg·mL-1時，在血腦屏障中已很難找到BMVECs，說明BMVECs已基本壞死，此時血腦屏障已完全被破壞，屏障功能基本消失(圖5f)。

3 討 論

從解剖學(xué)角度來看，血腦屏障包括腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞間的緊密連接、周細(xì)胞、基膜和包繞在毛細(xì)血管外周的星形膠質(zhì)細(xì)胞腳板、狹窄的細(xì)胞外間隙及其間的基質(zhì)。構(gòu)成屏障作用的主要是腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。由于其膜上無窗孔，缺少收縮性蛋白，胞飲小泡極少，細(xì)胞內(nèi)含有豐富的酶系統(tǒng),細(xì)胞間存在復(fù)雜的緊密連接(tight juncture，TJ)，故它可阻止多種物質(zhì)入腦，同時又選擇性地轉(zhuǎn)運多種營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物[12]。

本課題在已有研究的基礎(chǔ)上，采用原代培養(yǎng)大鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)的方法建立體外BBB模型，以模擬體內(nèi)BBB中腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞特性，并通過跨膜電阻值的測定來驗證模型的完整性，為研究納米銀顆粒通過BBB提供穩(wěn)定的實驗工具。

在建立體外血腦屏障模型的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)行了納米銀顆粒通過血腦屏障的劑量-效應(yīng)關(guān)系的研究。結(jié)果顯示，納米銀顆粒通過血腦屏障存在劑量－效應(yīng)關(guān)系。實驗結(jié)果顯示，當(dāng)納米銀劑量小于100μg·mL-1時，通過BBB的納米銀百分比變化不大，基本維持在2%左右。但當(dāng)納米銀劑量達(dá)到100 μg·mL-1后，隨著納米銀劑量的增加，通過BBB的納米銀百分比也不斷增大，當(dāng)劑量達(dá)到400μg·mL-1時，已有約15%的納米銀通過了血腦屏障。即當(dāng)納米銀顆粒劑量在 100～400μg·mL-1的范圍內(nèi)時，隨納米銀顆粒劑量增加，納米銀顆粒通過血腦屏障的比率也會相應(yīng)增加。

對血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步觀察，解釋了納米銀顆粒通過血腦屏障存在這種劑量-效應(yīng)關(guān)系的原因。當(dāng)納米銀顆粒劑量大于100μg·mL-1之后，血腦屏障中的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)了大量的壞死，構(gòu)成BBB主要屏障功能的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接也隨著內(nèi)皮細(xì)胞的壞死而被破壞，出現(xiàn)了明顯的間隙。因此，可以推斷，當(dāng)納米銀顆粒劑量大于100μg·mL-1后，納米銀顆粒對BMVECs的細(xì)胞毒性是導(dǎo)致納米銀顆粒通過的一個主要原因，稱之為“細(xì)胞毒性機(jī)理”。

當(dāng)納米銀顆粒的劑量小于100μg·mL-1時，依然發(fā)現(xiàn)有約2%左右的納米銀可以通過BBB。但超微結(jié)構(gòu)的觀測結(jié)果顯示此時構(gòu)成BBB主要屏障功能的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接結(jié)構(gòu)完整，連接緊密，即使小如納米級顆粒，依然不可能通過這種緊密連接而通過血腦屏障，那這2%的納米銀是怎樣通過BBB的了？此時通過對BBB超微結(jié)構(gòu)放大觀察可以發(fā)現(xiàn)，BMVECs中存在很多納米銀顆粒。如果把這一發(fā)現(xiàn)和只有納米銀顆?？梢酝ㄟ^血腦屏障的結(jié)果聯(lián)系起來，可以做出一個推測，納米銀顆?？梢赃M(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)部而微米銀顆粒不能進(jìn)入正是納米銀顆粒和微米銀顆粒通過血腦屏障能力有差異的根本原因。也就是說劑量小于100μg·mL-1時，納米銀顆粒通過血腦屏障的機(jī)理是腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞吞轉(zhuǎn)運，即納米銀顆粒首先被血管內(nèi)皮細(xì)胞吞噬到細(xì)胞內(nèi)部，然后通過內(nèi)皮細(xì)胞的胞吐作用從另外一側(cè)吐出內(nèi)皮細(xì)胞，使納米銀顆粒通過血腦屏障，我們稱這種納米銀顆粒通過血腦屏障的方式為 “細(xì)胞轉(zhuǎn)運機(jī)理”。

綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)在本研究的試驗條件下，納米銀顆?？梢酝ㄟ^“細(xì)胞毒性機(jī)理”和“細(xì)胞轉(zhuǎn)運機(jī)理”通過血腦屏障，納米銀顆粒通過血腦屏障很有可能是兩種機(jī)制共同作用的結(jié)果。在劑量較低時，納米銀顆粒主要通過“細(xì)胞轉(zhuǎn)運機(jī)理”通過血腦屏障，當(dāng)劑量大到足以對BMVECs產(chǎn)生足夠的細(xì)胞毒性時，“細(xì)胞毒性機(jī)理”將起主要作用。但是，在本研究中，因為使用的透射電鏡沒有配備EDS(energy dispersive spectrometer)檢測配件，所以沒能在觀測內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的同時，檢測在納米銀組內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的外源性類圓形顆粒(圖5b和圖5d)的化學(xué)組成，僅只通過和對照組與微米銀組透射電鏡圖片的比較，來推斷這些外源性類圓形顆粒是納米銀顆粒。

因此本研究對納米銀通過血腦屏障的能力和機(jī)理僅只能做初步推測，需要進(jìn)一步的元素分析和分子生物學(xué)研究加以驗證。然而，本研究的結(jié)果提示，在臨床使用含納米銀顆粒的醫(yī)療產(chǎn)品時，即使劑量很小，納米銀顆粒也存在通過血腦屏障的風(fēng)險。因此，必須在進(jìn)行充分的風(fēng)險評估基礎(chǔ)上[13-14]，再決定是否使用納米銀醫(yī)療產(chǎn)品。

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