郭 明 黃鳳琴 劉咪咪 李銘慧

(浙江農(nóng)林大學(xué)化學(xué)系，臨安 311300)

蛋白質(zhì)組學(xué)以蛋白質(zhì)組(Proteome)為研究對象，從蛋白質(zhì)整體水平研究蛋白質(zhì)功能表達(dá)，認(rèn)識生命活動規(guī)律[1-2]。人體蛋白質(zhì)組中，超過30%的蛋白質(zhì)含有單一或多個(gè)金屬離子，金屬離子對蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能起著關(guān)鍵的作用[3]。金屬離子絡(luò)合物/復(fù)合物結(jié)構(gòu)、功能的研究是無機(jī)化學(xué)的重要內(nèi)容，而分析金屬離子與生物大分子(蛋白質(zhì)、DNA、酶等)的結(jié)合反應(yīng)性能是無機(jī)化學(xué)發(fā)展的前沿領(lǐng)域之一。

重金屬鉻離子主要以三價(jià)和六價(jià)形式存在，Crバ對人體有益，而Crボ影響生物體葡萄糖、脂肪、蛋白質(zhì)的新陳代謝[4-5]，當(dāng)Crボ進(jìn)入血液后，可與血清中的高豐度組分如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、免疫球蛋白等相結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。血清白蛋白是人和動物血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，能夠與多種金屬離子相互作用[6-7]，免疫球蛋白是人體和動物體發(fā)揮免疫作用的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)鐵蛋白則是人體和動物體內(nèi)運(yùn)送鐵等金屬離子的載體蛋白，故在組學(xué)條件下研究Crボ與血清蛋白質(zhì)組的結(jié)合反應(yīng)性能對于理解Crボ-蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)、性能及生物體內(nèi)分布，闡釋Crボ-蛋白質(zhì)組絡(luò)合/復(fù)合作用機(jī)制，解釋鉻離子在生物體內(nèi)的代謝過程及評價(jià)Crボ的毒性具有一定的理論指導(dǎo)意義。

目前，生物活性小分子/離子與蛋白質(zhì)分子結(jié)合作用機(jī)制的研究是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一，核磁共振法[7]、熒光光譜法[8]、紅外光譜法[9]、圓二色譜法[10]等分析手段廣泛應(yīng)用，并取得了諸多成果，促進(jìn)該研究領(lǐng)域的發(fā)展，而利用色譜方法研究陸續(xù)也有報(bào)道。色譜方法中親和毛細(xì)管電泳(ACE)法具有樣品用量少、高靈敏度、高分辨率等特點(diǎn)，通過ACE法研究重金屬離子與單一蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)的報(bào)道已有相應(yīng)文獻(xiàn)[11-18]，而組學(xué)條件下通過ACE方法研究金屬離子與蛋白質(zhì)組結(jié)合反應(yīng)性能未見報(bào)道。重金屬離子與蛋白質(zhì)組的結(jié)合過程中，重金屬離子與所有蛋白質(zhì)相互結(jié)合，互相影響，故理想化的金屬離子與單一蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)模型不能全面反映金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)機(jī)制，而在組學(xué)條件下研究更具有實(shí)際意義。牛血清具有與人血清結(jié)構(gòu)和氨基酸序列高度相似，且低廉易得等特點(diǎn)，本文充分利用ACE對蛋白質(zhì)組的高效分離功能結(jié)合其對絡(luò)合物/復(fù)合物平衡性質(zhì)的檢測，研究Crボ與牛血清蛋白質(zhì)組結(jié)合反應(yīng)性能。通過分析Crボ與FBS高豐度組分結(jié)合反應(yīng)的有效淌度數(shù)據(jù)，進(jìn)行非線性擬合，獲得Crボ與血清蛋白質(zhì)組中高豐度組分相互作用的表觀結(jié)合常數(shù)，推斷Crボ與FBS結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

P/ACETMMDQ毛細(xì)管電泳儀(美國Beckman-Coulter公司)；未涂層熔融石英毛細(xì)管柱(60.2 cm×50 μm I.D.,有效長度50 cm)；KQ-250DB型數(shù)控超聲清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；Eppendorf移液槍(上?？蠌?qiáng)儀器有限公司)；ZD-2型精密酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；電子分析天平(十萬分之一，德國Sartorius公司)；1810D自動雙重純水蒸餾器 (美國Millipore 公司)。

牛血清(Fetal bovine serum,FBS;Purity≥98%，杭州四季青生物工程材料有限公司)；牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA;Purity≥96%,Sigma公司)； 牛 轉(zhuǎn) 鐵 蛋 白(Bovine apo transferrin,bATF;Purity≥98%)、牛免疫球蛋白(Bovine IgG,IgG;Purity≥98%)購置于上海浩然生物技術(shù)有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide，DMF，上海華美生物工程公司)；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為亞沸蒸餾去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ACE方法運(yùn)行緩沖液及樣品溶液的配制

稱取適量CrO3固體，以25 mmol·L-1Na2B4O7-NaOH空白緩沖液 (pH 9.27)溶解并配制成0.1 mmol·L-1Crボ儲備液 (CrO3在該 pH 下以 CrO42-存在，即鉻以六價(jià)形式存在[19-20]，以Crボ，表示鉻與血清蛋白質(zhì)作用時(shí)的初始價(jià)態(tài)，其并不代表鉻與血清蛋白質(zhì)作用時(shí)的最終化學(xué)式，后續(xù)Crボ表示相同含義)。移取系列不同體積Crボ儲備液，以Na2B4O7-NaOH緩沖液依次稀釋至所需濃度?？瞻拙彌_液和各Crボ緩沖液均用0.45μm混合纖維素酯微孔過濾并脫氣5 min，待用。

解凍后的胎牛血清用過濾脫氣后的Na2B4O7-NaOH空白緩沖液以10∶1稀釋，加入適量過濾脫氣后的0.5%DMF(用于檢測電滲流和遷移時(shí)間的重現(xiàn)性)混勻，待用。

1.2.2 FBS中高豐度組分的分析

FBS溶液進(jìn)行ACE分析的測定條件：壓力進(jìn)樣：2.068 5 kPa，進(jìn)樣時(shí)間：3 s；檢測波長：214 nm；分離電壓：25 kV；柱溫：25℃。實(shí)驗(yàn)操作程序：將樣品瓶置于樣品槽中，用0.1 mol·L-1NaOH、去離子水及空白緩沖液分別沖洗3 min，壓力進(jìn)樣，分離獲得FBS電泳譜圖。

內(nèi)標(biāo)添加法進(jìn)行ACE分析確認(rèn)FBS高豐度組分：適量BSA，bATF及牛IgG用Na2B4O7-NaOH緩沖液配成 1×10-5mol·L-1標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，0.45 μm 混合纖維素酯微孔過濾。逐一適量添加BSA，bATF及牛IgG標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液于FBS溶液中，渦旋搖勻，分別置于樣品瓶中，逐一通過ACE分析，檢測條件和程序同F(xiàn)BS溶液，獲得相應(yīng)的電泳譜圖。通過分析比較內(nèi)標(biāo)添加FBS溶液和FBS溶液電泳譜圖上遷移時(shí)間、峰高、峰面積變化情況，確定FBS中高豐度組分信息。

1．2．3 Crボ-FBS 相 互作 用體 系中 FBS 高豐 度組分有效淌度的測定

不含Crボ運(yùn)行緩沖液條件下，測定程序同1．2．2； 含 Crボ運(yùn)行緩沖液條件下，F(xiàn)BS 高豐度組分有效淌度的測定程序：實(shí)驗(yàn)前用0．1 mol·L-1NaOH、去離子水及空白緩沖液分別沖洗3 min，隨后用含相應(yīng)Crボ濃度運(yùn)行緩沖液沖洗5 min；其他測試程序同1．2．2，分別測定6次，求不同緩沖液條件下FBS中高豐度組分有效淌度的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 Crボ與FBS高豐度組分相互作用模型及相互作用理論方程

針對非共價(jià)鍵配體M(金屬離子)-受體P(蛋白質(zhì)分子)之間的相互作用體系(n M+P→MnP)，所形成的結(jié)合物MnP的表觀結(jié)合常數(shù)表達(dá)式如下：

受體P的平均電泳淌度(μ)變化值介于游離受體P(沒有配體M存在)的電泳淌度(μP)與結(jié)合物MnP的電泳淌度(μMnP)之間，其可以表示為[21-23]：

μMnP可用配體M濃度較高時(shí)測得受體P的電泳淌度(μMnP,∞)代替。將方程式(1)代入方程式(2)，得到受體P的平均電泳淌度μ。

在ACE方法中，一般不能準(zhǔn)確獲得遷移區(qū)帶中游離態(tài)M的濃度cMf，在配體M的合理范圍內(nèi)(通常配體M的濃度高于受體P濃度的10～100倍[24])可設(shè)定cMf等于運(yùn)行緩沖液中配體M的濃度cM，進(jìn)而由受體P的μ值和cM估算結(jié)合常數(shù)KB。前人研究金屬離子與HSA(人血清白蛋白)，BSA等單一蛋白質(zhì)分子結(jié)合反應(yīng)時(shí)，多采用簡化模型方法而考慮1∶1的配合物情況，本文也采用類似的簡化方法。n=1時(shí)，方程式(3)轉(zhuǎn)化為:

方程式(4)經(jīng)過處理可轉(zhuǎn)化為如下形式：

方程式(5)為以電泳淌度表示的位點(diǎn)結(jié)合模型，以1/(μ-μP)對1/cM進(jìn)行線性擬合，將所得直線的截距與斜率值相比即可得KB。但在實(shí)際的擬合過程中，μ與cM不存在線性關(guān)系，Bowser等[23]強(qiáng)調(diào)通過對ACE方法測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，特別在cM濃度合理范圍內(nèi)，計(jì)算結(jié)合常數(shù)能夠降低誤差。

從式(4)可知，不同的cM對應(yīng)不同的μ值。從電泳譜圖上，得到遷移時(shí)間，有效淌度計(jì)算公式如下:

方程式(6)中，μeff是受體 P 的有效淌度，μapp是其表觀淌度，μeof是電滲流淌度，t是從電泳譜圖中直接測得的受體P的遷移時(shí)間，teof是DMF的遷移時(shí)間，V是毛細(xì)管兩端的外加電壓，Lt是毛細(xì)管總長，Ld是從進(jìn)樣端到檢測窗口的有效長度。由式(6)計(jì)算出μeff，并把其作為式(5)中的μ(游離受體P的有效淌度或受體P的平均有效淌度)，然后對cM進(jìn)行非線性擬合更符合實(shí)際情況，所得的結(jié)果更為精確。因此本研究后續(xù)工作利用非線性擬合求KB。針對FBS蛋白質(zhì)組體系，根據(jù)式(4)進(jìn)行非線性擬合求表觀結(jié)合常數(shù)。

2.2 內(nèi)標(biāo)添加法分析FBS蛋白質(zhì)組分結(jié)果

按1．2．2實(shí)驗(yàn)，測得FBS蛋白質(zhì)組電泳譜圖。分析比較FBS溶液ACE譜圖與添加適量BSA，bATF及牛IgG標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的FBS溶液ACE譜圖，結(jié)果如圖1所示。

FBS譜圖表明，F(xiàn)BS蛋白質(zhì)組中明顯存在3個(gè)高豐度組分峰，依次為峰1，峰2與峰3。添加BSA標(biāo)準(zhǔn)樣品后，F(xiàn)BS中3個(gè)高豐度組分峰遷移時(shí)間基本不變，但峰3明顯增高，且峰面積增大，認(rèn)定峰3為BSA峰；添加bATF標(biāo)準(zhǔn)樣品后，F(xiàn)BS中3個(gè)高豐度組分峰遷移時(shí)間基本不變，但峰1明顯增高，且峰面積增大，認(rèn)定峰1為bATF峰；添加IgG標(biāo)準(zhǔn)樣品后，F(xiàn)BS中3個(gè)高豐度組分峰遷移時(shí)間基本不變，但峰2明顯增高，且峰面積增大，認(rèn)定峰2為IgG峰，由此確定FBS中高豐度組分為BSA，bATF和IgG。BSA、bATF、IgG在血清中占90﹪左右，其他蛋白含量較少，本工作采用的ACE方法也難以分離并檢測低豐度組分，故本文以下內(nèi)容均考慮以該3個(gè)高豐度組分為基礎(chǔ)開展相應(yīng)工作，低豐度FBS組分的影響可近似忽略。FBS中3個(gè)高豐度組分的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品等電點(diǎn)值及其相關(guān)數(shù)據(jù)見表1[25-26]。

表1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品基本物理量Table 1 Basic physical quantities of protein standards

2.2 ACE方法測定Crボ-FBS中3個(gè)高豐度組分相互作用后淌度變化

按1.2.3實(shí)驗(yàn)測定Crボ-FBS相互作用中3個(gè)高豐度組分的有效淌度，在不同運(yùn)行緩沖液條件下，DMF與FBS混合進(jìn)樣后得到相應(yīng)ACE譜圖，結(jié)果見圖2。

圖2表明，隨著Crボ濃度增大，F(xiàn)BS中各高豐度組分出峰時(shí)間均延長，區(qū)帶展寬。pH 9.27時(shí)，中性內(nèi)標(biāo)物的遷移時(shí)間基本不變，Crボ濃度增大不能顯著影響DMF的遷移行為，即DMF與Crボ之間沒有明顯的相互作用。bATF、IgG、BSA在pH 9.27空白緩沖液中均帶有負(fù)電荷，根據(jù)CE中不同電荷物質(zhì)出峰時(shí)間先后順序知FBS中3個(gè)高豐度組分在DMF之后被檢測到，這與圖1所示FBS中各高豐度組分峰均在DMF之后出峰一致。由圖2還可知：隨著運(yùn)行緩沖液中Crボ濃度的增大，在空白緩沖液中具有固定濃度的3個(gè)高豐度組分的出峰時(shí)間延長，區(qū)帶展寬。Crボ使結(jié)合物 Crボ-bATF、Crボ-IgG、Crボ-BSA所帶負(fù)電荷量增多，它們的電泳方向與電滲流相反，隨著Crボ濃度的增大，各峰的遷移時(shí)間增大。

試驗(yàn)中改變運(yùn)行緩沖液中Crボ濃度，可獲得不同濃度Crボ條件下FBS中3個(gè)高豐度組分和DMF的遷移時(shí)間，根據(jù)式(6)可計(jì)算不同濃度Crボ運(yùn)行緩沖液中3個(gè)高豐度組分的有效淌度，測定結(jié)果列于表2。由表2可見，bATF、IgG、BSA的有效淌度分別從-1.086 73×10-4cm2·V-1·s-1變化至-0.850 03×10-4cm2·V-1·s-1、 從-1.685 12×10-4cm2·V-1·s-1變化至-1.385 21×10-4cm2·V-1·s-1、從-2.026 13×10-4cm2·V-1·s-1變化至-1.525 13×10-4cm2·V-1·s-1， 這表明 Crボ-bATF、Crボ-IgG、Crボ-BSA 之間確實(shí)發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)，并且它們之間的相互作用逐漸增強(qiáng)。

表2 牛血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白、免疫球蛋白和白蛋白在含不同濃度Crボ運(yùn)行緩沖液中的有效淌度Table 2 Effective mobility of bATF,IgG and BSA in FBSunder the different concentrations of Crボ

以Crボ濃度為橫坐標(biāo)，以μeff為縱坐標(biāo)作圖，得到 Crボ-bATF、Crボ-IgG 與 Crボ-BSA 的 親和 曲線(圖 3)， 進(jìn)而可求得 Crボ-bATF、Crボ-IgG 與 Crボ-BSA結(jié)合物的平均有效淌度。按公式(4)非線性擬合，擬合結(jié)果列于表3中。

從圖3看出，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)基本接近擬合曲線，bATF、IgG與BSA的有效淌度隨著運(yùn)行緩沖液中Crボ濃度的增大而增大，因Crボ使結(jié)合物Crボ-bATF、Crボ-IgG、Crボ-BSA所帶的負(fù)電荷量增多，則隨著Crボ濃度的增大，bATF、IgG、BSA峰的遷移時(shí)間分別延長，區(qū)帶展寬，相對于bATF、IgG、BSA峰游離有效淌度 (-1．086 73×10-4，-1．685 12×10-4，-2．026 13×10-4cm2·V-1·s-1),結(jié)合物 Crボ-bATF、Crボ-IgG、Crボ-BSA 的平均有效淌度變?yōu)?0．824 97×10-4，-1．348 63×10-4，-1．472 31×10-4cm2·V-1·s-1， 這也證實(shí)了 Crボ-bATF、Crボ-IgG、Crボ-BSA 之間發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)非線性擬合得到Crボ-bATF、Crボ-IgG、Crボ-BSA 的表觀結(jié)合常數(shù) KB分別為 1．27×104、4．91×104、8．98×104L·mol-1。 為了比較分析組學(xué)條件及單一蛋白質(zhì)組分條件下，高豐度蛋白質(zhì)組分與Crボ結(jié)合反應(yīng)性能的差異，本工作選定BSA(費(fèi)用低)開展其與Crボ結(jié)合反應(yīng)的毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)，求得KCrボ-BSA=4．69×104L·mol-1，組學(xué)條件及單一蛋白質(zhì)組分條件下高豐度蛋白質(zhì)與Crボ結(jié)合反應(yīng)性能存在一定差異，推測其它高豐度蛋白質(zhì)組分與Crボ結(jié)合反應(yīng)具有類似結(jié)果。由此推斷，本文在組學(xué)條件下的獲得的BSA、bATF、IgG與Crボ結(jié)合反應(yīng)的毛細(xì)管電泳行為，即包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的影響(含BSA、bATF、IgG等之間的相互作用)、低豐度蛋白-Crボ結(jié)合反應(yīng)的影響及室溫、溶液等環(huán)境因素的影響，應(yīng)該比單獨(dú)考慮BSA、bATF、IgG與Crボ結(jié)合反應(yīng)的毛細(xì)管電泳行為更接近生理狀態(tài)，所獲得的結(jié)果為組學(xué)條件下BSA、bATF、IgG與Crボ結(jié)合反應(yīng)的綜合結(jié)果。依據(jù)結(jié)合反應(yīng)發(fā)生的快慢，可將結(jié)合體系分為快平衡(KB數(shù)量級為 104～106L·mol-1)和慢平衡(KB數(shù)量級為103L·mol-1)體系[27-29]。其中快平衡的一個(gè)特點(diǎn)是游離蛋白質(zhì)分子和結(jié)合物將難以分開，它們混合成一個(gè)條帶遷移，在電泳譜圖上表現(xiàn)為一個(gè)寬峰。根據(jù)表觀結(jié)合常數(shù)KB，我們發(fā)現(xiàn)Crボ-bATF、Crボ-IgG、Crボ-BSA 之間發(fā)生的結(jié)合反應(yīng)均為快平衡反應(yīng)，且Crボ-BSA之間的結(jié)合作用最強(qiáng)，其次是 Crボ-IgG、Crボ-bATF。本試驗(yàn)中，發(fā)生結(jié)合后的電泳譜圖峰數(shù)未增加，蛋白質(zhì)分子峰無變形，表明Crボ-bATF、Crボ-IgG、Crボ-BSA 之間的結(jié)合體系為快平衡體系。

表3 Crボ-FBS相互作用的非線性擬合結(jié)果Table 3 Results of non-linear curve fitting about the interactions between Crボand FBS

當(dāng)分析物分子在高壓電場作用下通過毛細(xì)管發(fā)生電泳遷移時(shí)，它的電泳淌度μ由兩個(gè)主要因素決定[30-33]：(1)分析物分子的荷/質(zhì)比；(2)分析物分子所處環(huán)境中其它化學(xué)物質(zhì)的影響。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子與質(zhì)量相對小的帶電配體發(fā)生相互作用時(shí)，結(jié)合物的電泳淌度發(fā)生變化主要是因?yàn)槠潆姾砂l(fā)生了變化，而因?yàn)槠滟|(zhì)量發(fā)生變化導(dǎo)致電泳淌度的改變可以忽略。在運(yùn)行緩沖液 pH條件下，Crボ使結(jié)合物 Crボ-bATF、Crボ-IgG、Crボ-BSA 所帶負(fù)電荷的量增大，則隨著Crボ離子濃度的增大，bATF、IgG、BSA峰的遷移時(shí)間延長，且BSA峰遷移時(shí)間延長的最多，其次是IgG和bATF，這也進(jìn)一步證實(shí)了BSA峰的表觀結(jié)合常數(shù)KB最大，其次是IgG和bATF。

2.3 金屬離子-蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)機(jī)制引起的電泳淌度變化的其他因素

2．3．1 緩沖溶液中影響因素

在該實(shí)驗(yàn)中，影響結(jié)合常數(shù)的因素包括荷/質(zhì)比、運(yùn)行緩沖液中所含有的化學(xué)物質(zhì)、運(yùn)行緩沖液的pH、溶液的粘度、離子強(qiáng)度等。本實(shí)驗(yàn)首先使Crボ和血清在同一緩沖液條件下運(yùn)行；其次使Crボ濃度低于空白緩沖液的濃度，并使Crボ濃度在0～10 KB范圍左右[34-36]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)求得的KB值，計(jì)算最佳Crボ濃度范圍為 0～7．87 mmol·L-1，而實(shí)驗(yàn)中 Crボ濃度范圍大致在該濃度范圍內(nèi)，添加Crボ濃度對運(yùn)行緩沖液的粘度、離子強(qiáng)度基本無變化，引起bATF、IgG、BSA 的有效淌度變化是 Crボ-bATF、Crボ-IgG、Crボ-BSA之間結(jié)合反應(yīng)的結(jié)果。

2．3．2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異對結(jié)合作用影響

天然產(chǎn)物等有機(jī)活性分子與蛋白質(zhì)等生物大分子之間的結(jié)合主要有疏水作用力、氫鍵作用力、范德華力和靜電引力等，而金屬離子與蛋白質(zhì)大分子之間的結(jié)合作用主要靠靜電引力[35]等。BSA分子是由585個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈，其中約67﹪的氨基酸以α-螺旋形成BSA二級結(jié)構(gòu)，BSA三級結(jié)構(gòu)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組成，進(jìn)而以槽口相對的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu)，活性分子/離子可通過包埋在圓筒結(jié)構(gòu)內(nèi)部進(jìn)而與白蛋白分子發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，結(jié)構(gòu)域Ⅱ與結(jié)構(gòu)域Ⅲ為主要的結(jié)合反應(yīng)位域；另一方面BSA分子中含有大量-OH、-NH2和-SH等極性官能團(tuán)，極性官能團(tuán)也是形成MnP絡(luò)合物的極好配位官能團(tuán)[36]；IgG分子為四肽鏈組成的基本結(jié)構(gòu)，兩條較長的肽鏈稱為重鏈(分子量較大)，兩條較短的肽鏈稱為輕鏈(分子量較小)，輕鏈與重鏈通過鏈間二硫鍵構(gòu)成IgG分子。IgG分子由3個(gè)結(jié)構(gòu)域形成Y形或T形三級結(jié)構(gòu)，每一輕鏈和重鏈在其N-末端有一可變區(qū)，在其C-末端有一不變區(qū)。每個(gè)可變區(qū)中均有一個(gè)由鏈內(nèi)二硫鍵連接形成的肽環(huán)，每個(gè)可變區(qū)域氨基酸的組成和排列具有可變性，故可結(jié)合多種具有不同結(jié)合抗原特異性的抗體，也是Crボ與IgG的活性結(jié)合位域[37]；bATF是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)和功能上類似的結(jié)構(gòu)域組成的單一肽鏈糖蛋白，其立體結(jié)構(gòu)是在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上折疊成2個(gè)相等的葉 (N-葉和C-葉)，每個(gè)葉狀結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)Fe3+的結(jié)合部位，但此部位存在于一個(gè)很深的裂隙中。分析蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，BSA含較多的分子/離子結(jié)合部位，其圓筒狀三級結(jié)構(gòu)使Crボ較易進(jìn)入其結(jié)構(gòu)域空腔與親和基團(tuán)接觸形成絡(luò)合物，同時(shí)疏水氨基酸殘基形成的外圍空腔能將進(jìn)入的Crボ牢牢裹住，充分結(jié)合，所以結(jié)合作用力較強(qiáng)，結(jié)合常數(shù)較大；其次，bATF的結(jié)合部位深陷在裂隙中[38]，使Crボ較難進(jìn)入裂隙與親和基團(tuán)鍵合，所以結(jié)合力較弱，結(jié)合常數(shù)較??；IgG分子中含有少量親和基團(tuán)，Crボ可以進(jìn)入可變區(qū)與IgG發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。但I(xiàn)gG可變區(qū)域的Y或T形結(jié)構(gòu)為疏水區(qū)域結(jié)構(gòu)，Crボ不容易包裹在其中，較易流出，所以IgG結(jié)合作用適度。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KCrボ-BSA＞KCrボ-IgG＞KCrボ-bATF， 結(jié)果表明 Crボ-BSA 之間的結(jié)合作用最強(qiáng)，其次是Crボ-IgG、Crボ-bATF，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)相一致。

3 結(jié) 論

(1)在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下，依據(jù)毛細(xì)管電泳譜圖，確定FBS中bATF、IgG、BSA高豐度組分峰，并基于確認(rèn)的高豐度組分開展Crボ與蛋白質(zhì)組的結(jié)合反應(yīng)性能研究，F(xiàn)BS中存在其他低豐度及極低豐度組分，這些低豐度及極低豐度組分也可能與Crボ發(fā)生結(jié)合作用，這些結(jié)合反應(yīng)對組學(xué)條件下Crボ-蛋白質(zhì)絡(luò)合物/復(fù)合物的形成起著一定作用，但鑒于目前蛋白質(zhì)組分離技術(shù)的限制，尚不能完全清晰FBS全組分組成及含量，故只能基于目前現(xiàn)有的ACE技術(shù)手段開展Crボ與高豐度蛋白質(zhì)組的結(jié)合反應(yīng)性能研究。

(2)在蛋白質(zhì)組學(xué)條件下，以DMF為內(nèi)標(biāo)物，構(gòu)建配體Crボ-受體(FBS)相互作用模型，計(jì)算有效淌度的變化， 發(fā)現(xiàn) Crボ-bATF、Crボ-IgG、Crボ-BSA 相互作用后的有效淌度均較游離bATF、IgG、BSA的有效淌度有所增加，表明Crボ確與FBS中bATF、IgG、BSA發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)；其次基于位點(diǎn)結(jié)合方程，通過非線性擬合方程計(jì)算Crボ-FBS中3個(gè)高豐度組分結(jié)合反應(yīng)的表觀結(jié)合常數(shù) KCrボ-bATF、KCrボ-IgG、KCrボ-BSA；定量表征了Crボ與 FBS中 bATF、IgG、BSA結(jié)合作用強(qiáng)度及絡(luò)合物穩(wěn)定性，并解析電泳譜圖獲得了Crボ-FBS中高豐度組分的結(jié)合反應(yīng)為一快平衡體系的結(jié)論。

(3)依據(jù)親和曲線變化表明，得到結(jié)合反應(yīng)作用強(qiáng)度即絡(luò)合物穩(wěn)定性與運(yùn)行緩沖液中Crボ濃度存在量效關(guān)系，隨溶液中Crボ濃度的提高，結(jié)合作用也隨之增強(qiáng)，當(dāng)Crボ濃度提高到一定濃度時(shí)，結(jié)合作用不再改變；同時(shí)通過文獻(xiàn)查閱BSA、IgG、bATF分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，表明蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)所得表觀結(jié)合常數(shù) KCrボ-BSA＞KCrボ-IgG＞KCrボ-bATF結(jié)果相吻合。表明在蛋白質(zhì)組學(xué)條件下，以ACE方法研究Crボ與血清蛋白質(zhì)組的結(jié)合反應(yīng)性能有效、可行。

本研究初步探索了組學(xué)條件下金屬離子與蛋白質(zhì)組的結(jié)合反應(yīng)性能，相應(yīng)結(jié)果可為生物無機(jī)化學(xué)類似工作提供前期工作基礎(chǔ)，有關(guān)工作可為重金屬離子-蛋白質(zhì)絡(luò)合物結(jié)合性能等研究提供一定參考。

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