張昆南 曹金娟劉世民 胡國(guó)柱 李沁妤 楊海玉 吳梨華 吳曉牧

腦梗死已成為我國(guó)第二大死亡病因，且是導(dǎo)致后天性殘疾的重要原因［1］。腦梗死可引起梗死區(qū)及周?chē)M織嚴(yán)重缺血缺氧，從而導(dǎo)致細(xì)胞水腫，組織興奮性中毒，致使神經(jīng)功能受到損害。腦缺血后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生并產(chǎn)生膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP），急性期反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生具有神經(jīng)保護(hù)作用，而后期可形成疤痕組織影響神經(jīng)元的修復(fù)［2］。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）由激活的巨噬細(xì)胞／單核細(xì)胞分泌，是種多效性的促炎細(xì)胞，腦梗死后能快速分泌并達(dá)高峰。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用，同時(shí)維持成熟神經(jīng)的正常功能。巢蛋白（Nestin）在神經(jīng)胚胎形成階段一過(guò)性、特異性地表達(dá)于神經(jīng)內(nèi)皮干細(xì)胞，并在神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)元終末分化后表達(dá)下調(diào)，因而，Nestin可作為神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)志。神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）是神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物［3］。腦梗死區(qū)周?chē)窠?jīng)及膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥壞死及營(yíng)養(yǎng)和增殖是影響其神經(jīng)功能的重要因素。本研究觀察大腦中動(dòng)脈缺血再灌注（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠急性期及亞急性期腦組織TNF－α、GFAP、NSE、BDNF、Nestin的表達(dá)，旨在探討腦梗死不同時(shí)期的腦組織炎癥及其神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞變化特征，以期為腦梗死的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Sprague-Dawley雄性大鼠30只（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：HNASLKJ20123909，SPF級(jí)），體質(zhì)量250～300 g，20～25℃室溫，晝夜比1∶1，自然進(jìn)水和食物飼養(yǎng)；栓線（北京東沙生物技術(shù)有限公司，AAAA級(jí)）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；GFAP（Abcam 公司）；NSE（Abcam 公司）；BDNF（Abcam公司）；Nestin（Abcam 公司）；TNF-α（Abcam公司）；光學(xué)顯微鏡（Leica，DM3000）。

1.2 方法

1.2.1 MCAO模型制作與分組：參照Longa等［4］線栓法制作大鼠MCAO模型。所有的動(dòng)物術(shù)前禁食不禁水12h，以10%（體積分?jǐn)?shù)）水合氯醛（0.3mL／100mg）腹腔注射麻醉，維持肛溫37℃，背位固定，取頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎、剪斷頸外動(dòng)脈。從頸外動(dòng)脈殘端插入直徑為0.26mm栓線至大腦前動(dòng)脈，深度約為18～22mm，以阻斷大腦中動(dòng)脈血液供應(yīng)，縫合皮膚組織，2h后將栓線拔至頸外動(dòng)脈殘端以實(shí)現(xiàn)再灌注。采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠隨機(jī)分為 MCAO術(shù)后1d組（n＝5），3d組（n＝6），7d組（n＝6），14d組（n＝6），21d組（n＝7）。

1.2.2 改良神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度量表評(píng)分（mNSS）：MCAO術(shù)后1、3、7、14、21d對(duì)大鼠進(jìn)行mNSS評(píng)分［5］。mNSS評(píng)分包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡木4項(xiàng)測(cè)試，滿(mǎn)分為18分，不能執(zhí)行任務(wù)或反射缺乏加1分，13～18分為重度損傷，7～12分為中度損傷，1～6分為輕度損傷。術(shù)后第1天mNSS評(píng)分為7～12分者納入實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 免疫組化染色：分別于 MCAO術(shù)后1、3、7、14、21d經(jīng)水合氯醛腹腔麻醉大鼠，開(kāi)胸、開(kāi)腹，夾閉腹主動(dòng)脈，將連有輸液器的針頭插入左心室并剪開(kāi)右心耳，先灌注150mL生理鹽水，隨后再用4%（質(zhì)量濃度）多聚甲醛進(jìn)行灌注。待灌注完成后取出大腦，將腦組織放入裝有4%（質(zhì)量濃度）多聚甲醛的容器中固定4～6h，取腦梗死中心區(qū)腦組織（約為冠狀位前囟－1.0～＋1.0mm）石蠟包埋，石蠟切片，片厚4μm，用于免疫組化染色。采用微波修復(fù)，切片置于濃度為0.01mol／L、pH6.0的枸櫞酸緩沖液中，置微波爐中100℃沸騰3次，再微波爐調(diào)至30℃，15min，取出自然放涼至室溫。二步法免疫組化反應(yīng)：以3%（質(zhì)量濃度）H2O2去離子水孵育5～10min，PBS沖洗2min×3次；滴加一抗，分別為 GFAP（1∶2500）、NSE（1∶750）、BDNF（1∶100）、Nestin（1∶170）、TNF-α（1∶1000），放入濕盒4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗2min×3次；滴加山羊抗兔HRP標(biāo)記IgG抗體，室溫30 min，PBS沖洗2min×3次；DAB顯色，蒸餾水充分沖洗；復(fù)染－脫水－透明－中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液取代一抗，其余步驟同前。

1.2.4 圖像采集與分析：光學(xué)顯微鏡采集圖像，每只大鼠每個(gè)指標(biāo)取2張玻片，并按圖1示意采集圖片。采用Image pro-Plus 5.1 軟 件計(jì)數(shù) GFAP、NSE、Nestin、TNF-α，計(jì)算BDNF、NSE的累積吸光度（IOD）值。

圖1 免疫組化檢測(cè)各指標(biāo)采集大鼠腦腦梗死區(qū)域示意圖

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，若方差齊性，兩兩比較采用LSD法進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)的多重比較；若方差不齊則采用Dunnett T3法進(jìn)行樣本均數(shù)的多重比較。以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分隨時(shí)間推移逐漸下降，除14d組與21d組之間比較其mNNS評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異之外，余各時(shí)間點(diǎn)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表1）。

2.2 各組大鼠腦組織GFAP的表達(dá) GFAP＋細(xì)胞主要聚集在梗死區(qū)周?chē)?，隨時(shí)間的推移其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，胞體增大，突起多且粗大，7d達(dá)高峰（P＜0.05）；而后細(xì)胞數(shù)量減少，胞體較小且細(xì)胞突起變少而纖長(zhǎng)（表1，圖2）。

2.3 MCAO大鼠腦組織NSE的表達(dá) NSE＋細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增多，且細(xì)胞著色更均勻（圖2），其中1d組顯著小于3、7、14、21d組，21d顯著大于3、7d組（P＜0.05），余各組兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

2.4 各組大鼠腦組織BDNF的表達(dá) BDNF＋細(xì)胞著色主要位于胞漿和細(xì)胞膜表面胞漿，而核周?chē)旧^淺（圖2）。BDNF的IOD值在14d下降至最低值，而后上升，其中1d組和21d組大于14d組（P＜0.05），余各組兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

2.5 各組大鼠腦組織Nestin的表達(dá) Nestin＋細(xì)胞在再灌注后7d達(dá)高峰，胞體變大，染色增強(qiáng)（圖2），7d組明顯高于1d、3d組（P＜0.05），余各組兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

2.6 MCAO大鼠腦組織TNF-α的表達(dá) 各組大鼠腦組織TNF-α表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但1d組至7 d組TNF-α＋細(xì)胞有增加趨勢(shì)，其后則有逐漸下降趨勢(shì)（表1，圖2）。

表1 大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分及腦組織各指標(biāo)表達(dá)比較 （±s）

表1 大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分及腦組織各指標(biāo)表達(dá)比較 （±s）

注：與前一時(shí)間點(diǎn)比較，＊P＜0.05；與1d組比較，＃P＜0.05；與3d組比較，△P＜0.05；與7d組比較，▲P＜0.05；與1d組和21d組比較，◇P＜0.05

組別 n mNSS評(píng)分 GFAP＋細(xì)胞（個(gè)數(shù)）NSE（IOD）BDNF（IOD）Nestin＋細(xì)胞（個(gè)數(shù)）TNF-α＋細(xì)胞（個(gè)數(shù)）121.95 7.00± 7.87 15.58±14.14 3d組 6 8.33±0.81＊ 17.12±10.79 160.19± 90.88＃ 140.78± 97.70 19.58±14.33 16.37±15.26 7d組 6 6.72±0.89＊ 28.69±14.05?！?168.67± 94.57＃ 121.43±101.89 47.67±21.56＃△ 19.56±26.00 14d組 6 5.16±0.83＊ 23.03± 7.51＃ 181.77±132.01＃ 85.56± 89.11◇ 31.09±19.94 10.00±11.41 21d組 7 4.16±0.75 17.14±11.83 214.59±120.90?！鳌?182.43±148.95 21.40±12.05 9.30±14.70 F值1d組 5 10.17±0.86 10.15± 6.26 95.78± 89.99 205.53±0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.12 121.282 15.073 8.269 8.586 10.340 3.265 P值

圖2 大鼠腦缺血再灌注后梗死灶周?chē)X組織GFAP、NSE、BDNF、Nestin及TNF－α表達(dá)（箭頭所示，免疫組化，DAB顯色，比例尺＝50.0μm）

3 討論

腦梗死病理過(guò)程復(fù)雜，多種細(xì)胞及細(xì)胞因子直接或間接參與腦組織缺血性炎癥及腦組織修復(fù)過(guò)程，然而目前對(duì)腦梗死在急性期和亞急性期中一些與腦組織炎癥、神經(jīng)及膠質(zhì)細(xì)胞修復(fù)等相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子的變化規(guī)律卻缺乏系統(tǒng)性研究，因此對(duì)于臨床早期干預(yù)治療缺乏足夠的研究結(jié)果支持，影響患者的康復(fù)。

TNF-α由激活的巨噬細(xì)胞／單核細(xì)胞分泌，在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫等病理生理中發(fā)揮著重要作用。大量研究證實(shí)腦缺血伴隨著炎癥的產(chǎn)生，而缺血再灌注后劇烈的炎癥反應(yīng)能加重神經(jīng)元的損傷［6－8］。促炎因子 TNF－α是導(dǎo)致大腦缺血再灌注損傷的重要介質(zhì)之一［9］。Sunwoo等［10］報(bào)道減少炎癥細(xì)胞的產(chǎn)生對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)元具有保護(hù)作用。但同時(shí)也有報(bào)道指出，TNF-α能刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的增生和活化［11－12］，從而產(chǎn)生抗炎等作用。TNF基因敲除實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)TNF具有神經(jīng)保護(hù)作用［13］。本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注急性期時(shí)隨時(shí)間推移TNF-α表達(dá)逐漸上調(diào)，在7d達(dá)高峰，后則逐漸下降，炎癥開(kāi)始減輕，神經(jīng)功能則逐漸好轉(zhuǎn)，提示缺血再灌注后伴隨產(chǎn)生的TNF-α在早期誘導(dǎo)釋放強(qiáng)效的血管活性物質(zhì)，導(dǎo)致腦血管收縮，降低局部血流量，促使腦組織缺血。高濃度TNF-α促使星形膠質(zhì)細(xì)胞活化而維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡，減少谷氨酸鹽等，從而啟動(dòng)腦組織損傷的修復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)［14］。本研究結(jié)果顯示TNF－α在各組間表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與樣本量不足有關(guān)。

腦缺血損傷導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、活化并高表達(dá)GFAP。星形膠質(zhì)細(xì)胞增生加速攝取興奮性毒素谷氨酸鹽［15］，促進(jìn)血管再生，穩(wěn)定細(xì)胞外流體及離子平衡，減少血管性水腫［16］，參與腦組織重建［17］。Schmidt-Kastner 等［18］報(bào) 道 腦 缺 血 后GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在2d開(kāi)始升高，8d達(dá)高峰。本研究發(fā)現(xiàn)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在1～7d逐漸增加并達(dá)高峰，神經(jīng)功能也有所改善，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。TNF-α能刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增生和活化［11－12］，從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究亦發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注急性期TNF＋細(xì)胞有升高趨勢(shì)，至第7天達(dá)高峰，隨后有下降趨勢(shì)，但各時(shí)間點(diǎn)間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)GFAP＋細(xì)胞表達(dá)亦達(dá)高峰，表明急性期炎癥的結(jié)束。在急性期，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生維持缺血半暗帶離子濃度，形成阻止谷氨酸釋放的屏障，保護(hù)缺血半暗帶，為神經(jīng)元提供能量［19］，亞急性期星形膠質(zhì)細(xì)胞下降以減輕膠質(zhì)瘢痕對(duì)新生神經(jīng)元和突觸的不利作用，從而利于神經(jīng)功能的恢復(fù)。

BDNF能促進(jìn)神經(jīng)和血管的生成［20］，改善運(yùn)動(dòng)功能［21］，并促進(jìn)感覺(jué)器官的恢復(fù)［22］。BDNF基因敲除小鼠表現(xiàn)出大腦發(fā)育、感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)缺陷，常在出生后即死亡［23］。BDNF增加自由基清道夫的活性，減少氧自由基誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡；調(diào)節(jié)細(xì)胞外鈣流入或釋放細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鈣維持細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，從而抑制氨基酸興奮性中毒［24］；促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化和神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，故BDNF對(duì)神經(jīng)具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，BDNF出現(xiàn)雙峰反應(yīng)，缺血再灌注后第1天神經(jīng)細(xì)胞應(yīng)激性分泌增加，隨后下降，而第21天上升，這可能是缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞第7天后緩慢增殖和成熟產(chǎn)生BDNF，事實(shí)上大鼠神經(jīng)功能也在逐漸恢復(fù)。提示BDNF促進(jìn)了神經(jīng)和血管生成，減少氧自由基，抑制氨基酸興奮性中毒，促進(jìn)神經(jīng)功能的好轉(zhuǎn)。

Nestin屬于Ⅵ類(lèi)中間纖維絲蛋白，特異性地表達(dá)在神經(jīng)上皮干細(xì)胞和反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞上，對(duì)神經(jīng)元的分化起作用。Nestin在大腦損傷、缺血、炎癥等病理情況下可重新表達(dá)［25］，現(xiàn)已證明腦損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞重表達(dá)Nestin蛋白對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，從而使其免受損傷后低氧等帶來(lái)的一系列損害［26］。Yu等［27］研究發(fā)現(xiàn)，增加大鼠海馬區(qū)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞能促使缺血再灌注后功能的恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示，再灌注后第7天Nestin增加達(dá)高峰，其表達(dá)水平與GFAP相隨。推測(cè)Nestin陽(yáng)性神經(jīng)干細(xì)胞或GFAP陽(yáng)性的反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的Nestin促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化，導(dǎo)致NSE陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞分化成熟，神經(jīng)功能逐漸修復(fù)。因而，延長(zhǎng)Nestin的持續(xù)時(shí)間及增強(qiáng)其作用可以作為未來(lái)臨床治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的手段之一。

NSE是一種酸性可溶性蛋白質(zhì)，存在于神經(jīng)細(xì)胞。烯醇酶參與催化a磷酸甘油酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，這對(duì)維持神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能極為重要。本研究結(jié)果顯示，隨時(shí)間推移NSE值逐漸上升，并與神經(jīng)功能評(píng)分變化趨勢(shì)相反，其原因可能與缺血缺氧狀態(tài)下神經(jīng)元的存活需要NSE提供大量ATP以滿(mǎn)足核酸合成的需求有關(guān)［28］。NSE的逐漸增加也證明Nestin在早期的升高和后期的維持促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞向成熟的神經(jīng)元分化，其有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。

綜述所述，隨時(shí)間遷移，MCAO大鼠神經(jīng)功能呈現(xiàn)出自我修復(fù)的過(guò)程。急性期，GFAP、Nestin表達(dá)的增加提示其能保護(hù)缺血半暗帶，為神經(jīng)元提供能量，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化。TNF-α表達(dá)提示在缺血再灌注后早期其可誘導(dǎo)釋放強(qiáng)效的血管活性物質(zhì)，導(dǎo)致腦血管收縮，降低局部血流量，促使腦組織缺血和炎癥的發(fā)展。急性期后，BDNF、NSE表達(dá)上調(diào)可為受損腦細(xì)胞、神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，利于神經(jīng)功能的恢復(fù)。因此，MCAO在急性期（7 d前）受損腦組織產(chǎn)生炎癥及抗炎反應(yīng)明顯，急性期后（7d后）以神經(jīng)生長(zhǎng)因子產(chǎn)生并促進(jìn)神經(jīng)再生為主，對(duì)今后腦梗死的基礎(chǔ)研究及治療提供新的策略。

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