劉 晶 溫志英 韓清波

(河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院1，石家莊 050061)(石家莊君樂寶乳業(yè)集團有限公司2，石家莊 050221)

米渣是制造怡糖、葡萄糖、味精、淀粉、糊精等過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品。目前多將其干燥后用作動物飼料，但工業(yè)附加值低［1］。米渣中蛋白質量分數(shù)60%以上，是大米含量的5～8倍，且高于大豆蛋白(含量35% ～40%)，是良好的蛋白質資源［2］。用酶法水解米渣蛋白，不但能充分利用米渣中的蛋白質，還可產(chǎn)生具有生物活性的大米小分子肽。人體小腸吸收氨基酸的能力差，而對相對分子質量小于1 000的寡肽極易吸收利用，已經(jīng)證明一些寡肽具有特殊的生理功能如抗疲勞特性［3］。許多研究表明動物和人類進行體育運動可使自由基的產(chǎn)生增加。正常情況下，體內(nèi)不斷產(chǎn)生活性氧(ROS)，但不會對機體產(chǎn)生嚴重的損害。如果ROS產(chǎn)生過多或抗氧化能力下降，體內(nèi)ROS代謝出現(xiàn)失衡，導致產(chǎn)生氧化應激或氧化損傷，從而使機體產(chǎn)生疲勞。Singh等［4］用抗氧化劑灌喂小鼠，發(fā)現(xiàn)攝入抗氧化物質提高了小鼠體內(nèi)還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的水平，減少了脂類的過氧化，這表明體內(nèi)抗氧化能力的提高，表現(xiàn)在小鼠在游泳過程中靜止時間的減少，即延緩了疲勞的產(chǎn)生［5］。Wang 等［6］發(fā)現(xiàn)，豬胰臟中的十肽(Pro－Thr－Thr－Lys－Thr－Tyr－Phe－Pro－His－Phe)可以提高游泳耐力，延緩疲勞。這一肽段中富含Pro、Tyr、His和Phe等具有抗氧化性的氨基酸。Yu等［7］發(fā)現(xiàn)具有高自由基清除活性(62%的超氧陰離子清除活性和96%的羥基自由基清除活性)的脫脂大豆肽可以顯著延緩小鼠的游泳疲勞。此外草魚肽也具有抗疲勞的作用［8］。米渣肽抗疲勞特性的研究對開發(fā)新的抗疲勞肽具有重要作用?？蛊诿自牡姆蛛x鑒定對深入研究肽的抗疲勞機理具有理論意義。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

大米渣:武漢味全食品有限公司;葡萄糖試劑盒、乳酸試劑盒、游離脂肪酸試劑盒、血尿素氮試劑盒和糖原試劑盒:南京建成生物工程中心;堿性蛋白酶:諾維信;大孔樹脂DA201－C:天津市海光化工有限公司;色譜分析試劑為色譜純;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Zorbax SB－C18色譜柱:美國 Agilent;SuperdexTM Peptide 10/300 GL色譜柱和 KTA avant25液相色譜儀:美國GE Healthcare Life Sciences;PPSQ－31A蛋白測序儀:日本Shimadzu Corporation。

1.3 方法

1.3.1 米渣肽的制備工藝［9］

米渣→加水→調pH→調溫→加酶(堿性蛋白酶)→酶解(調pH)→滅酶→離心→上清液→米渣肽純化→真空干燥(米渣肽)。1.3.2 米渣肽的純化及分級

用大孔吸附樹脂 DA201－C(裝于2.5 cm×30 cm層析柱)凈化以除去米渣中的可溶性糖和鹽。在 pH 6.0條件下，控制樣品流速為0.75 BV/h，用去離子水洗脫乳糖和鹽。然后用75%的乙醇洗脫，流速為0.5 BV/h，在220 nm處測定洗脫液的吸光度。收集洗脫峰物質(米渣肽，RSP)［10］。采用不同截留相對分子質量(1 000和5 000)的超濾膜對米渣肽進行分離。得到米渣肽Ⅰ(RSPⅠ，相對分子質量＜1 000)、米渣肽Ⅱ(RSPⅡ，相對分子質量 1 000～5 000)和米渣肽Ⅲ(RSPⅢ，相對分子質量 ＞5 000)。

1.3.3 常規(guī)成分的測定

蛋白質含量的測定:參照 GB 5009.5—2010［11］;脂肪含量的測定:參照 GB 5413.3—2010［12］;含水量的測定:參照 GB/T 5009.3—2010［13］;灰分含量的測定:參照 GB/T 5009.4—2010［14］。

1.3.4 樣品和小鼠處理

50只小鼠被分為5組(每組n=10)。每組實驗鼠分別灌胃如下分組中的物質，灌胃劑量為1.5 g蛋白/kg體重:(1)對照組(0.9%生理鹽水);(2)RSP組;(3)RSPⅠ組;(4)RSPⅡ組;(5)RSPⅢ組。上述所有樣品都溶解在0.9%的生理鹽水中，給實驗鼠的灌胃劑量為每天200μL，持續(xù)6周。

1.3.5 游泳耐力試驗

試驗用 Bostrom 等［15］和 Kamakura 等［16］的方法經(jīng)過略微的改動進行測定。小鼠的游泳能力是通過在一個裝滿水的深度為35 cm(90 cm×45 cm×45 cm)的丙烯酸塑料池內(nèi)測定的。池內(nèi)水溫控制在(34±1)℃。這些鼠的尾部負載有大約其體重的8%的鉛護套。若鼠在5 s內(nèi)不能到水面呼吸則說明它們已經(jīng)疲勞，記錄時間即為游泳疲勞時間。游泳運動在每周的第7天進行。為了避免實驗鼠體力活動的晝夜變化，游泳運動在11:00到17:00進行，經(jīng)證實，在這個時間段，鼠的耐力變化最小。在第6周的最后一天，實驗鼠游泳過后迅速被殺死以供進一步的研究。

1.3.6 血漿生化指標的分析

用肝素管進行全血的標本采集。血漿在4℃以1 000 r/min 離心10 min，然后于 －70 ℃保存［17－18］。葡萄糖、乳酸、游離脂肪酸(NEFA)和血液中尿氮(BUN)的含量是用商業(yè)試劑盒進行分析的。

1.3.7 米渣肽的分子篩色譜分離

取1 mg樣品用20 mm磷酸緩沖液溶解到1 mL，并離心(12 000 r/min，離心10 min)取上清。采用 KTA avant 25系統(tǒng)和 SuperdexTM Peptide 10/300 GL柱子。進樣體積為100μL，平衡緩沖液為20 mm磷酸緩沖液(pH 7.0)，進樣流量為 0.6 mL/min，在214 nm檢測。

1.3.8 米渣肽的反相高效液相色譜(RP－HPLC)純化

1.3.9 肽的氮端測序

利用混合氨基酸標準品，在常規(guī)條件下運行生成一張標準品色譜圖;對混合氨基酸標品的保留時間進行校正，生成標準方法文件。將反相純化出來的樣品離心后取上清，備用;將聚凝胺15μL加到玻璃纖維膜上，氮氣吹干;上機將玻璃纖維膜預處理，即運行5個循環(huán);將足量樣品點加到預處理后的玻璃纖維膜上，氮氣吹干。將加好樣品的玻璃纖維膜用濾膜封置于蛋白測序儀PPSQ－31A的反應器里，設定檢測氨基酸數(shù)及其他參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(Mean±SD)表示，組間顯著性比較采用SPSS 11.5數(shù)據(jù)處理軟件進行單項方差分析(S－N－K)，顯著性P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 米渣肽的成分分析

由表1可以看出，不同組之間的蛋白質含量有顯著差異，為了排除蛋白含量的不同對米渣肽抗疲勞性的影響，灌胃小鼠的蛋白含量是相同的。不同組之間脂肪和灰分的含量也具有顯著性差異。Tong等［18］發(fā)現(xiàn)，乳糖、礦物質、其他低分子質量化合物和磷脂沒有抗疲勞作用，說明花生粕蛋白是抗疲勞的主要物質。因此，他們是否對抗疲勞特性有影響在這里沒有討論。

表1 米渣肽的成分

2.2 小鼠游泳疲勞時間的變化

由表2可以看出，在第1周時，雖然灌胃RSP和不同相對分子質量的肽組分都可以延長小鼠游泳時間，但不同組之間的游泳疲勞時間沒有顯著性差異(P＞0.05)。在第2周時，僅RSPⅠ組與對照組有顯著性差異(P＜0.05)，但和RSP組之間沒有顯著性差異。第4周和第6周時，RSPⅠ組不僅與對照組有顯著性差異(P＜0.05)，而且與RSP組有顯著性差異(P＜0.05)。在第6周時，與對照組相比，RSPⅡ和RSPⅢ可以顯著延長游泳時間(P＜0.05)，但與RSP組相比沒有顯著性差異(P＞0.05)。低相對分子質量的米渣肽(相對分子質量＜1 000)顯著延長游泳時間，說明低分子肽具有一定的抗疲勞效果。

表2 灌胃不同物質小鼠游泳時間的變化

2.3 小鼠血漿中葡萄糖、乳酸、NEFA和BUN的含量

回想當年廣東王朝的建立，正是源于完備而專業(yè)的青訓系統(tǒng)。杜鋒、朱芳雨、王仕鵬從青澀的黃毛小子逐步成為隊中主心骨，在老大哥李群帶領下摧毀了八一王朝，宣告廣東宏遠的時代來臨。隨后宏遠隊8奪CBA總冠軍追平八一隊紀錄建立屬于自己的廣東王朝。期間，陳江華、劉曉宇、蘇偉、周鵬、董瀚麟、王征、高尚、陳大偉、季樂、于梁、曲紹斌等大批年輕才俊如雨后春筍不斷充實宏遠后備陣容，板凳深度傲視前聯(lián)盟。

如表3所示，在5組小鼠中，RSPⅠ組血漿葡萄糖值最高，與其他組(RSPⅡ組除外)相比有顯著性差異(P＜0.05)。與對照組相比，所有的米渣肽都可以提高血漿中的葡萄糖含量，但RSP、RSPⅡ和RSPⅢ組之間沒有顯著性差異(P＜0.05)。與對照組和RSP組相比，RSPⅠ組可以顯著降低血乳酸的含量，但其他組之間沒有顯著性差異。各組間NEFA和BUN含量沒有顯著性差異(P＞0.05)。

表3 游泳疲勞后小鼠血漿生化參數(shù)

血乳酸是厭氧糖酵解的產(chǎn)物，高強度的運動如游泳可以引發(fā)酵解刺激物如ADP、AMP和磷酸的聚集。由于ATP的供給和消耗不均衡，加速了糖酵解的速率和丙酮酸的產(chǎn)生，導致乳酸的生成。血乳酸的含量通常都作為評價疲勞的生化指標。RSPⅠ可以顯著降低血乳酸的含量，因此低分子肽具有良好的抗疲勞作用。血糖是劇烈運動最先消耗的能量物質，RSPⅠ組的血糖含量最高，可以延緩由于血糖降低引起的不良變化，從而延緩疲勞。脂肪酸的利用率提高，相應的NEFA含量增加，這意味著脂肪代謝增加，相應的降低了葡萄糖的利用，提高了運動能力［19］。雖然RSPⅠ與對照組和RSP組比可以提高NEFA的含量，但沒有顯著差異，說明灌胃低相對分子質量肽對小鼠這一指標的影響不明顯。灌胃低分子肽可以提高蛋白質的吸收性，但灌胃RSPⅠ沒有顯著提高BUN的含量。綜上，相對分子質量＜1 000的肽可以顯著延緩小鼠的疲勞。

2.4 米渣肽的分子篩色譜分離

由圖1可以看出米渣肽組成復雜，相對分子質量小于1 000的米渣肽經(jīng)分子篩色譜分離后具有多個峰，取優(yōu)勢峰物質Y1作為純化的目標肽。

圖1 RSPⅠ的分子篩高效液相色譜分離圖

2.5 Y1的RP－HPLC純化

分子篩液相色譜是通過分子的大小和形狀的不同分離目標物質的，因此得到的峰物質Y1是分子大小和形狀相近的肽。為了保證Y1的純度，需要對Y1進一步純化。RP－HPLC是根據(jù)分子疏水性的差異進行肽的分離。兩種色譜的分離原理不同，具有相近分子質量及形狀的肽疏水性可能差異很大，因此通過兩種方式的色譜分離可以使分離后的肽的純度提高。將Y1通過RP－HPLC分離純化后，得到一個純化的肽P1，結果如圖2所示。

圖2 肽P1的反相高效液相色譜分離圖

2.6 組分P1的氮端測序結果

通過蛋白測序儀測定肽P1的氨基酸組成如圖3所示，P1肽段共有5個氨基酸，組成為Gln－Ser－Pro－Glu－Ile。

圖3 Edman降解后的肽P1氨基酸序列圖

根據(jù)前人研究，N－端具有疏水性氨基酸如纈氨酸和異亮氨酸的肽具有較高的抗氧化活性，因為疏水性氨基酸，可以捕捉自由基［20－21］。在多肽鏈，高含量的Pro，Tyr和 His可以提高肽的抗氧化能力。肽P1 N－末端是Ile，且肽鏈中含有Pro，Ile等抗氧化氨基酸，這是肽P1具有高抗氧化性的原因。給小鼠灌胃具有高抗氧化性肽可以延緩自由基引發(fā)的疲勞，這是低分子質量肽具有抗疲勞效果的原因。

3 結論

3.1 采用堿性蛋白酶對米渣進行酶解，酶解的產(chǎn)物經(jīng)大孔樹脂純化得到RSP。通過超濾分離，得到RSPⅠ(相對分子質量＜1 000)、RSPⅡ(相對分子質量1 000～5 000)和RSPⅢ(相對分子質量＞5 000)3種米渣肽組分。

3.2 與對照組和RSP組相比，RSPⅠ可以顯著延長小鼠游泳的疲勞時間和小鼠血糖含量，并顯著降低血乳酸含量。因此相對分子質量＜1 000的低相對分子質量肽可以顯著延緩小鼠的運動疲勞。

3.3 采用高效液相色譜對小分子肽進行純化，得到一個優(yōu)勢小肽，對其序列進行分析，得到它的氨基酸組成為Gln－Ser－Pro－Glu－Ile。根據(jù)其組成氨基酸的特點，發(fā)現(xiàn)這個肽具有高抗氧化性，可以延緩由自由基引發(fā)的疲勞。

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