馬 寧 朱科學(xué) 郭曉娜 彭 偉 周惠明

(江南大學(xué)食品學(xué)院，無錫 214122)

近年來，由于禽流感、口蹄疫等動物疾病的發(fā)生和宗教信仰、素食主義等原因，替代肉制品越來越受到人們的重視。組織化植物蛋白(TVP)以植物蛋白為原料，經(jīng)擠壓加工得到。TVP蛋白質(zhì)含量高(一般高于56%，干基)，無膽固醇，復(fù)水后具有肉類的纖維結(jié)構(gòu)和咀嚼感，是一種理想的肉類替代品［1］。

作為TVP的主要成分，蛋白質(zhì)的變化及蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)之間的相互作用是TVP組織化得以形成的關(guān)鍵，也是擠壓植物蛋白組織化機(jī)理研究的主要內(nèi)容和焦點。前人的研究多集中在對大豆蛋白和花生蛋白的探討上，研究表明，不同擠壓原料、操作參數(shù)下得到的研究結(jié)果有很大出入［2］。本試驗以谷朊粉為主要原料，系統(tǒng)研究了小麥面筋蛋白在擠壓過程中的變化及擠壓過程中蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)之間的作用，為制備高質(zhì)量的TWP提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

谷朊粉:安徽古井集團(tuán)，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)76.2%，干基;小麥粉:安徽瑞福祥食品有限公司，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.1%，干基。

1.2 儀器和設(shè)備

DYY－Ⅲ23A型電泳槽:北京六一儀器廠;Nexus智能傅立葉紅外光譜儀:美國Thermo Nicolet公司;Agilent1100液相色譜儀:美國安捷倫公司;UV－2800型紫外分光光度計:尤尼柯上海儀器制造公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小麥面筋蛋白擠壓試驗

擠壓試驗在布勒中國無錫擠壓實驗室完成，擠壓機(jī)型號CAMPACtwinTM62，螺桿直徑62 mm，長徑比20∶1。喂料速度:150 kg/h;調(diào)制器用水溫度:常溫;擠壓機(jī)Ⅱ區(qū)、Ⅲ區(qū)、Ⅴ區(qū)的溫度分別為155℃、155℃、175℃;物料含水量:24.0%(以物料100%計);螺桿轉(zhuǎn)速:400 r/min;?？壮叽?2 mm×56 mm;小麥粉質(zhì)量分?jǐn)?shù):7.0%，谷朊粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.0%。

1.3.2 小麥面筋蛋白擠壓前后亞基變化

采用SDS－PAGE法分析小麥面筋蛋白擠壓前后亞基的變化［3］。

選用10%分離膠，4%濃縮膠，考馬斯亮藍(lán)G－250染色。上樣液的配制:精確稱取10.3 mg的樣品溶解于1 mL的上樣緩沖液中，離心(16 000×g，10 min)取上清液。還原和非還原的SDS－PAGE的區(qū)別在于加與不加β－巰基乙醇(2－ME)。采用兔磷酸化酶B(97 400 u)、牛血清白蛋白(66 200 u)、兔肌動蛋白(43 000 u)、牛碳酸酐酶(31 000 u)、胰蛋白酶抑制劑(20 100 u)、雞蛋清溶菌酶(14 400 u)作為相對分子量標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 小麥面筋蛋白擠壓前后溶解度試驗及化學(xué)交聯(lián)鍵分析

參照 Prudencio－Ferreira等［4］的方法，利用蛋白質(zhì)在不同裂解液中溶解度的不同分析蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的交聯(lián)方式。

浸提溶液:A、pH7.6，0.035 mol/L 磷酸鹽緩沖液;B、pH7.6 ，A+0.015 g/mL SDS;C、pH7.6，A+0.1 mol/L 2 － ME;D、A+pH7.6，0.015 g/mLSDS+0.1 mol/L 2 －ME。

蛋白質(zhì)浸提:原料(WG)和擠壓樣品(TWP)冷凍干燥后粉碎備用。稱取冷凍干燥后的待測樣0.500 g左右，分別加入10 mL上述不同浸提液中，在恒溫水浴振蕩器中室溫浸提2 h，離心(16 000×g，10 min)后取上清液。沉淀中再分別加入10 mL上述浸提液，重復(fù)浸提，離心。合并兩次上清液于50 mL容量瓶中，定容，得樣品蛋白質(zhì)浸提溶液。蛋白質(zhì)含量用改良后微量凱氏定氮法測定。試驗重復(fù)2次。

蛋白質(zhì)溶解度=［上清液中蛋白質(zhì)(g)/樣品中蛋白質(zhì)(g)］×100%

化學(xué)交聯(lián)鍵分析:參考 Hanger［5］的方法。①天然狀態(tài)蛋白質(zhì)，即溶解于pH7.6磷酸鹽緩沖液中的蛋白質(zhì);②以非共價鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)=溶于B－溶于A;③以共價鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)=溶于C－溶于A;④以二硫鍵和非共價鍵交互作用結(jié)合的蛋白質(zhì)=溶于D－溶于B－溶于C+溶于A。

1.3.4 小麥面筋蛋白擠壓前后游離巰基的變化

采用 DTNB 的方法測定［6－7］。稱取240 mg左右的樣品加到10 mL5 mol/L pH 8.0鹽酸胍/Tris－Gly溶液中，磁力攪拌 10 min，離心(5 000×g，30 min)，分別取5 mL鹽酸胍/Tris－Gly和1.5 mL 1×10－3mol/L DTNB，將上述兩種溶液分別加入到3 mL上清液中?；旌弦涸?5℃恒溫水浴10 min后，在412 nm處測定吸光值?？捡R斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。

游離巰基(μmol/g蛋白質(zhì))=(73.53×A412×D)/c

式中:73.53=106/13 600，D 為稀釋倍數(shù)(取值為9.5/3)，c為樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/g/L。

1.3.5 小麥面筋蛋白擠壓前后半胱氨酸分析［8］

稱取120 mg的樣品與10 mL水解管中，加入5 mL 6 mol/L的鹽酸溶液酸水解，充氮封管，110℃下水解24 h。切開封管，洗滌定容至10 mL容量瓶中。抽干后，采用鄰苯二甲醛OPA柱前自動衍生，上Agilent1100液相色譜儀進(jìn)行氨基酸組成分析。

1.3.6 小麥面筋蛋白擠壓前后二級結(jié)構(gòu)的變化

采用傅里葉紅外光譜測定擠壓前后小麥面筋蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)［9］。

樣品用研缽研碎，37℃真空干燥。取少量樣品與溴化鉀混合，放入瑪瑙研缽中，紅外燈下研磨10 min。10 kg壓力下壓制成厚薄均勻、呈半透明狀的薄片。將壓制好的薄片放入紅外光譜儀中掃描，得到樣品的傅里葉紅外光譜圖。測試前，先測空白背景圖。在 OmnicV6.2軟件內(nèi)扣除背景后，采用peakfitV4.2軟件進(jìn)行相應(yīng)的圖譜處理分析。

1.4 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用 Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和繪圖。使用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，選取Duncan測試，在P＜0.05檢驗水平對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 擠壓組織化對小麥面筋蛋白亞基的影響

從圖1非還原SDS－PAGE可以得知，與原料Y2有多個亞基條帶相比，J2樣品中幾乎觀察不到亞基條帶，僅在20 100 u和14 400 u有顏色較淺的條帶出現(xiàn)，且泳道上方也未見蛋白質(zhì)聚集體，表明沒有出現(xiàn)溶出的蛋白未進(jìn)入分離膠的情況。Anderson等［10］在研究面粉擠壓前后的變化時，也得出相同結(jié)果。結(jié)合非還原的SDS－PAGE溶解液中只添加了SDS，無β－巰基乙醇，樣品中只有以非共價鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)發(fā)生裂解，溶于樣品溶解液中。可以推斷:擠壓過程中，大量的小麥面筋蛋白亞基以共價鍵的連接形式發(fā)生了交聯(lián)，進(jìn)而導(dǎo)致擠壓組織化的樣品并未被裂解溶于樣品溶解液中，故J2中無明顯條帶出現(xiàn)。

圖1 小麥面筋蛋白擠壓前后SDS－PAGE電泳圖

對比還原SDS－PAGE電泳圖可以發(fā)現(xiàn):J1樣品電泳條帶中，97 400～14 400 u之間各亞基條帶顏色明顯變淺，高分子質(zhì)量蛋白區(qū)(97 400～47 000 u)顏色變淺尤為明顯，但依然可以看出并未有條帶消失。且未出現(xiàn)新的亞基條帶，在大于97 400 u的位置和濃縮膠頂端出現(xiàn)了顏色較深的條帶。結(jié)合以上現(xiàn)象可以得出:小麥面筋蛋白經(jīng)擠壓組織化后，并未發(fā)生亞基的裂解，而是發(fā)生聚合、交聯(lián)等變性反應(yīng)，生成分子質(zhì)量較大的聚合物。這些聚合物中較大分子質(zhì)量的不能透過濃縮膠進(jìn)入分離膠，較小的則透過濃縮膠，在分離膠的頂端發(fā)生聚集［11］。且這些聚合物可能是以酰胺鍵的形式結(jié)合，因為還原性的SDSPAGE溶解液中含有SDS和β－巰基乙醇，可同時將非共價鍵和二硫鍵裂解。

2.2 擠壓組織化對小麥面筋蛋白溶解度及化學(xué)交聯(lián)鍵的影響

構(gòu)成蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的力的作用類型是多樣的、復(fù)雜的，常見的有二硫鍵(共價鍵)、氫鍵、疏水作用、離子鍵、靜電作用等其他非共價鍵。2－ME和SDS可以分別破壞蛋白質(zhì)分子之間的二硫鍵和非共價鍵(主要是疏水作用和氫鍵)，利用樣品在不同化學(xué)鍵破壞溶劑中的溶解度的不同，可分析樣品蛋白質(zhì)之間力的作用類型和重要性［12］。

表1 擠壓組織化對小麥面筋蛋白溶解度的影響

由表1可知，擠壓組織化后，TWP在A(磷酸鹽緩沖液)中的溶解度變化不顯著(P＞0.05)，在 B(SDS)和、C(2－ME)、D(SDS+2－ME)溶液中的溶解度均顯著下降(P＜0.05)。

為了更直觀的分析各交聯(lián)鍵對維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)，將樣品在不同裂解液中的溶解度轉(zhuǎn)換為化學(xué)鍵的形式［4］，如表2所示。

表2 不同結(jié)合狀態(tài)小麥面筋蛋白的溶解度/%

從表2可知，維持原料小麥面筋蛋白之間交聯(lián)的貢獻(xiàn)大小依次是非共價鍵＞二硫鍵和非共價鍵交互＞天然狀態(tài)＞二硫鍵，擠壓組織化之后，蛋白質(zhì)之間的作用力依次是二硫鍵和非共價鍵交互＞非共價鍵＞天然狀態(tài)＞二硫鍵?？梢酝茢?，在擠壓過程中，有少量的非共價鍵出現(xiàn)斷裂，同時二硫鍵大量生成;維持TWP的主要化學(xué)鍵并不是某種單一的化學(xué)作用力，而是二硫鍵和非共價鍵之間的交互作用。

Liu等［13］分析了大豆蛋白在擠壓過程中蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)之間的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn):擠壓過程中有大量的二硫鍵形成，非共價鍵并未有顯著改變，二硫鍵對組織化蛋白纖維結(jié)構(gòu)的形成起最重要作用;Cheftel［14］也指出，影響擠壓組織化產(chǎn)品的化學(xué)鍵應(yīng)該是共價鍵，因為在150℃、高剪切作用下，氫鍵、疏水鍵和靜電作用可能會打破。但張汆［15］通過研究擠壓花生蛋白認(rèn)為:非共價鍵結(jié)合(疏水作用和氫鍵)作用是影響組織化結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵，其次才是二硫鍵。不同研究結(jié)果可能是由于擠壓機(jī)、擠壓原料、擠壓條件不同所致。為了更直觀的探討二硫鍵在擠壓過程中的變化，我們對小麥蛋白擠壓組織化前后游離巰基和半胱氨酸的含量進(jìn)行了分析。

從表1中還可以發(fā)現(xiàn):小麥面筋蛋白和TWP在D溶液中的溶解度分別為95.73%和84.67%。這說明，在小麥面筋蛋白和TWP中，還分別有15%、5%左右的蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)鍵并未被SDS和2－ME打破，且擠壓組織化之后，這部分蛋白顯著的增加。這可能是由于:①SDS和2－ME并不能打破所有的非共價鍵和二硫鍵，尤其是種類較多的非共價鍵。未溶解的蛋白可能是以離子鍵、靜電作用等其他SDS不能打破的非共價鍵的方式交聯(lián);②SDS和2－ME打破非共價鍵和二硫鍵的能力不足以完全破壞小麥面筋蛋白和TWP中的非共價鍵和二硫鍵，從而使蛋白質(zhì)并未被完全浸提出。具體的原因還需進(jìn)一步的研究探討。

2.3 擠壓組織化對小麥面筋蛋白游離巰基及半胱氨酸含量的影響

從表3可知，擠壓組織化之后，小麥面筋蛋白中游離巰基含量顯著的減少(P ＜0.05)。Li等［16］認(rèn)為，擠壓后游離巰基的減少可以說明小麥面筋蛋白在擠壓過程中發(fā)生了變性，并通過分子間二硫鍵聚合。游離巰基減少通常伴隨著二硫鍵的增加，一般學(xué)者認(rèn)為這是由于巰基發(fā)生氧化所致。Anderson等［10］則認(rèn)為，在擠壓過程，巰基的減少還有可能是由于高剪切和熱的作用。

表3 擠壓組織化對小麥面筋蛋白中游離巰基的影響

小麥面筋蛋白中含硫氨基酸——半胱氨酸含量擠壓過后減少了32%。半胱氨酸的減少可能是兩個原因所致:半胱氨酸的巰基發(fā)生氧化，形成二硫鍵;半胱氨酸也可能與其他物質(zhì)結(jié)合，生成具有擠壓風(fēng)味的揮發(fā)性有機(jī)物。但目前還未有研究結(jié)果可以支持后者［17］。因此，可以得出，小麥面筋蛋白在擠壓組織化過程中，減少的半胱氨酸發(fā)生了氧化，生成二硫鍵。

2.4 擠壓組織化對小麥面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

從圖2可知，小麥面筋蛋白經(jīng)擠壓組織化后，α－螺旋、無規(guī)則卷曲、β－折疊均有所減少，其中α－螺旋減少了33%，最為劇烈。β－轉(zhuǎn)角增加了73%。這可能是因為:α－螺旋在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中是最不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)［18］。因此，在擠壓過程中，α－螺旋首先轉(zhuǎn)化為較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，但并未完全發(fā)生轉(zhuǎn)變，仍保留部分α－螺旋。少量的無規(guī)卷曲和β－折疊也轉(zhuǎn)變?yōu)棣拢D(zhuǎn)角。由此可見，擠壓組織化過程中，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)并未被完全破壞，只是發(fā)生了由部分不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)向穩(wěn)定構(gòu)象的轉(zhuǎn)變。

圖2 谷朊粉擠壓前后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化

前人對擠壓植物蛋白組織化的二級結(jié)構(gòu)研究很少，而且主要集中在大豆蛋白的研究?？盗帲?］認(rèn)為，擠壓大豆蛋白組織化時，β－折疊幾乎保持不變，α－螺旋已完全轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)角，無規(guī)卷曲也有所增加。且他指出，可將α－螺旋是否完全發(fā)生轉(zhuǎn)化作為大豆蛋白是否完全組織化的微觀標(biāo)準(zhǔn)。與本試驗結(jié)果比較，有一定的相同點，如轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的增加和α－螺旋的減少，但并不完全相同。這可能與原料、擠壓機(jī)、操作參數(shù)的不同所引起。綜上所述，植物蛋白組織化過程中，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化是否有一定的共性，是否可以從二級結(jié)構(gòu)的變化來判斷組織化的形成及程度仍需要進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。

3 結(jié)論

3.1 綜合小麥面筋蛋白擠壓組織化前后 SDSPAGE、溶解度變化、游離巰基變化及半胱氨酸的變化可知，擠壓組織化過程中，有大量二硫鍵生成，非共價鍵幾乎不變。

3.2 維持TWP蛋白質(zhì)之間的力主要是二硫鍵和非共價鍵的交互作用，以單一的非共價鍵和二硫鍵結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)僅占12.81%和0.91%。

3.3 擠壓組織化并未完全破壞小麥面筋蛋白的的二級結(jié)構(gòu)，其中的α－螺旋、無規(guī)則卷曲、β－折疊向穩(wěn)定的β－轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變。目前的研究還不能從二級結(jié)構(gòu)的變化來判斷組織化是否形成及形成程度。

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