唐志剛 溫 超 王 恬 周巖民

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京 210095)

隨著生活水平的提高，畜產(chǎn)品質(zhì)量受到廣泛關(guān)注，飼料所帶來的畜產(chǎn)品安全越來越受到重視。為了提高畜產(chǎn)品質(zhì)量，人們越來越傾向于無污染、無殘留的飼料添加劑。作為替代抗生素的一種新型綠色添加劑，益生菌能提高家禽生產(chǎn)性能，使飼料利用率提高 3.9%～ 32.2%［1－2］，尤其養(yǎng)殖環(huán)境不太理想的情況下效果更佳;同時，益生菌可調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)平衡，提高免疫力，增強(qiáng)機(jī)體對內(nèi)、外環(huán)境不良刺激的抵抗能力［3］。但畜禽養(yǎng)殖中，益生菌的促生長、促免疫作用受諸多因素影響，應(yīng)用效果差異較大。因此，全面認(rèn)識微生態(tài)系統(tǒng)對營養(yǎng)代謝和免疫功能的調(diào)控作用就顯得十分重要。目前，有關(guān)益生菌的試驗研究大多集中于常規(guī)日糧，而在低營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌對動物抗氧化功能、黏膜免疫影響的研究則鮮見報道。本試驗通過在不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌，研究其對肉雞免疫器官指數(shù)、抗氧化功能、腸黏膜免疫及腸道菌群的影響，評估益生菌在宿主內(nèi)的免疫效應(yīng)并探究其機(jī)理，為研發(fā)抗生素替代品和節(jié)約飼料資源提供理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

益生菌由北京九州互聯(lián)農(nóng)牧有限公司提供，以枯草芽孢桿菌為主要菌種，并包含地衣芽孢桿菌和乳酸桿菌等，產(chǎn)品活菌總數(shù)大于1.0×1010CFU/g。

1.2 試驗動物及日糧

1日齡AA肉雞由安徽和威集團(tuán)提供，試驗為期42 d，其中1～21 d為試驗前期，22～42 d為試驗后期。試驗日糧參照NRC(1994)《家禽的營養(yǎng)需要量》配制(表1)。

表1 日糧的組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))/%

1.3 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗采用2×2雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，選用1日齡肉雞320只，隨機(jī)分成4組，每組10個重復(fù)，每個重復(fù)8只雞，分別飼喂以下4種日糧:

正對照組(NC):基礎(chǔ)日糧;

負(fù)對照組(LC):低能低蛋白日糧，使基礎(chǔ)日糧前后期的代謝能均降低320 kJ/kg，粗蛋白均降低0.85%;

試驗1組(NP):基礎(chǔ)日糧+0.01%益生菌，其日糧活菌總數(shù)大于1.0×106CFU/g;

試驗2組(LP):低能低蛋白日糧+0.01%益生菌，其日糧活菌總數(shù)大于1.0×106CFU/g。

試驗雞于室內(nèi)同一環(huán)境下采用層疊籠飼養(yǎng)，每籠為一重復(fù)，24 h光照，每天喂料2次，自由采食和飲水，以重復(fù)為單位每天記錄飼料飼喂量和剩余量，每天清洗飲水器和料槽1次。免疫接種及疾病預(yù)防、消毒按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.4 樣品采集與測定

在試驗的第21天和第42天，每組隨機(jī)選取8只中等大小的公雞屠宰，放血致死后迅速剖開腹腔，取脾臟、胸腺、法氏囊并稱重，計算各器官指數(shù)。器官指數(shù)=器官重/雞活體重。

采集血液置于離心管中，待血清析出后，在低溫離心機(jī)中以3 000 r/min離心15 min，取上清液(血清)分裝，測定血清丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T－SOD)和總抗氧化能力(T－AOC)。取十二指腸和空腸前半段，用眼科剪縱向剖開，清除表層食糜后再用載玻片刮取黏膜，將部分黏膜用4℃生理鹽水10倍體積稀釋后勻漿，4℃離心20 min(4 000 r/min)，取上清液分裝，測定黏膜勻漿液的MDA、TSOD和T－AOC。血液和腸黏膜MDA、T－SOD和T－AOC所用試劑盒由南京建成生物工程研究提供。

黏膜免疫球蛋白G(IgG)用競爭性放射免疫分析技術(shù)測定(試劑盒由濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司所提供)。黏膜分泌性免疫球蛋白A(SIgA)采用競爭性放射免疫分析技術(shù)測定(試劑盒由原子高科股份有限公司所提供)。

1.5 腸道菌群的測定

分別于試驗的第21天和第42天時，每組隨機(jī)選取4只中等大小的公雞屠宰，無菌條件下取回腸內(nèi)容物0.5 g左右，用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋;采用平板菌落計數(shù)法，大腸桿菌使用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基37℃有氧培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù);乳酸桿菌使用MRS瓊脂培養(yǎng)基37℃有氧培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計數(shù)，結(jié)果以每克腸道內(nèi)容物中細(xì)菌個數(shù)的對數(shù)lg(CFU/g)表示。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件GLM模型進(jìn)行兩因子方差分析，模型主效應(yīng)包括日糧的營養(yǎng)水平(N/L)、益生菌不添加或添加(C/P)以及二者的互作，用Duncan進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(X±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

由表2可知，益生菌能極顯著提高21 d肉雞的胸腺指數(shù)(P＜0.01)，顯著提高21 d脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)(P＜0.05)，對42 d的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)均沒有顯著影響(P＞0.05);日糧營養(yǎng)水平及其與益生菌的互作對21 d和42 d的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)均沒有顯著影響(P＞0.05)。

表2 不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌對免疫器官指數(shù)的影響/g/kg

2.2 不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌對血清抗氧化性能的影響

由表3可知，益生菌能提高肉雞前期血清TSOD的活性(P＜0.05)，降低肉雞前期血清MDA的含量(P＜0.01)，能提高后期血清T－SOD和 TAOC活性(P＜0.01)，降低后期 MDA的含量(P＜0.05);日糧營養(yǎng)水平對血清前、后期的 T－SOD、MDA和T－AOC均無顯著影響(P＞0.05);益生菌和日糧營養(yǎng)水平的互作對血清前期抗氧化功能無顯著影響(P ＞0.05)，對后期 T －SOD(P=0.094)和T－AOC(P=0.060)有提高趨勢，對后期MDA無顯著改變(P ＞0.05)。

表3 不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌對血清抗氧化功能的影響

2.3 不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌對黏膜抗氧化性能、免疫功能的影響

由表4可知，益生菌能顯著提高黏膜21 d的TSOD活性(P＜0.05)，對21 d黏膜MDA含量也有一定降低趨勢(P=0.057)，能顯著降低42 d黏膜MDA含量(P＜0.05)，對T－SOD和T－AOC沒有顯著影響(P＞0.05);日糧營養(yǎng)水平對21 d、42 d黏膜抗氧化性能沒有顯著影響(P＞0.05);益生菌和營養(yǎng)水平的互作對黏膜抗氧化影響不大(P＞0.05)。

表4 不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌對黏膜抗氧化功能的影響

益生菌對飼喂不同營養(yǎng)水平日糧肉雞黏膜IgG和SIgA的影響見表5。益生菌可顯著提高21 d黏膜IgG的含量(P＜0.05)，對21 d黏膜SIgA含量沒有影響(P＞0.05)，顯著提高42 d黏膜IgG和SIgA含量(P＜0.01或P＜0.05);日糧營養(yǎng)水平對肉雞前后期的黏膜IgG和SIgA均沒有顯著影響(P＞0.05)。

表5 不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌對肉雞黏膜免疫的影響/ng/mg prot

2.4 不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌對肉雞回腸菌群的影響

如表6所示，益生菌能降低21 d、42 d回腸大腸桿菌數(shù)量(P＜0.05)，提高21 d回腸乳酸桿菌的數(shù)量(P＜0.001)，對42 d回腸乳酸桿菌數(shù)量沒有顯著影響(P＞0.05);日糧營養(yǎng)水平對21 d回腸乳酸桿菌數(shù)量有顯著影響(P＜0.05)，對21 d大腸桿菌沒有顯著影響(P＞0.05)，對42 d大腸桿菌、乳酸桿菌數(shù)量均沒有影響(P＞0.05);益生菌和日糧營養(yǎng)水平的互作對21 d、42 d回腸菌群均沒有顯著影響(P＞0.05)。

表6 益生菌在不同營養(yǎng)水平下對肉雞腸道菌群的影響/lg(CFU/g)

3 討論

3.1 不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

胸腺、法氏囊和脾臟作為肉雞最重要的免疫器官，其發(fā)育狀態(tài)和機(jī)能強(qiáng)弱直接影響家禽的免疫機(jī)能［4－5］。益生菌能促進(jìn)胸腺、法氏囊等免疫器官的生長發(fā)育，提高動物對外界刺激和疾病的抵抗力［6］。趙希彥［7］研究表明，添加0.2%芽孢桿菌制劑使21 d肉雞的脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)顯著提高。本試驗結(jié)果表明，在不同營養(yǎng)水平下添加益生菌，特別是低營養(yǎng)水平日糧中，肉雞前期胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)均有所提高，對肉雞后期的免疫器官指數(shù)沒有影響，這表明添加益生菌后，可適當(dāng)降低日糧營養(yǎng)水平，在保證動物正常生長的同時，可促進(jìn)肉雞前期的免疫器官發(fā)育，完善肉仔雞免疫系統(tǒng)。而肉雞后期自身的免疫功能已健全，應(yīng)對外界刺激的能力增強(qiáng)，添加益生菌對對肉雞后期免疫器官指數(shù)無明顯效果。

3.2 不同營養(yǎng)水平下日糧中添加益生菌對血清抗氧化性能的影響

機(jī)體的抗氧化體系是由酶促和非酶促抗氧化體系共同維持的，酶促抗氧化體系主要包括谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶以及過氧化氫酶等，它們可以有效清除O－、H2O2、ROOH等中的活性氧并終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。血液SOD活性、MDA含量以及T－AOC是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。本試驗研究表明，在低營養(yǎng)水平下添加益生菌，都能提高血液T－SOD的活性，降低血液MDA的含量，對T－AOC也有一定提高，這與段穎等［8］、楊家軍等［9］在蛋雞和小鼠中的研究報道一致，提示益生菌能增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減少過氧化物對機(jī)體的損傷。

3.3 不同營養(yǎng)水平下日糧中添加益生菌對肉雞腸道黏膜抗氧化和免疫的影響

腸道黏膜處于溝通機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的重要位置，黏膜的完整性是維持腸道正常功能的重要保證，對保護(hù)腸道具有重要意義。MDA可與蛋白質(zhì)、核酸(DNA、RNA)和磷脂等含有氨基的物質(zhì)交聯(lián)，引起黏膜或細(xì)胞損傷。黏膜中的SOD能夠消除超氧陰離子的毒性，保護(hù)黏膜和腸壁細(xì)胞免受損傷［10］。有研究表明，益生菌能產(chǎn)生多種抗氧化酶，如超氧化物歧化酶［11］、含錳過氧化氫酶［12］、谷胱甘肽過氧化物酶［13］等，可清除黏膜自由基，防止過氧化反應(yīng)損害腸道黏膜。本試驗表明，在不同營養(yǎng)水平下添加益生菌能提高肉雞黏膜的T－SOD活性，降低黏膜的MDA含量，增強(qiáng)總抗氧化能力，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。這提示益生菌能增加黏膜抗氧化能力的作用，保護(hù)腸道黏膜，維持腸道正常功能，從而促進(jìn)動物健康生長。

腸道黏膜中IgG和SIgA可以加強(qiáng)腸道細(xì)胞吞噬作用，，是防御病菌在腸道黏膜黏附和定植的第一道防線［14－15］。益生菌可在腸道黏附定植，發(fā)揮特異性免疫作用活化相關(guān)淋巴組織，使SIgA生物合成增加，提高黏膜免疫功能［16］。Vinderola 等［17］用瑞士乳桿菌灌喂小白鼠發(fā)現(xiàn)，小腸中SIgA漿細(xì)胞量有所增加，提示益生菌能增強(qiáng)黏膜免疫功能。本試驗中，在不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌，能提高21 d肉雞腸道黏膜中的IgG和42 d黏膜SIgA水平，這表明益生菌能增強(qiáng)肉雞的黏膜免疫功能，其作用機(jī)理可能是:益生菌及其分泌物可作為抗原發(fā)揮免疫佐劑作用，活化腸黏膜內(nèi)的微皺褶細(xì)胞和派伊氏淋巴結(jié)，與腸道上皮細(xì)胞及黏膜固有層免疫細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)腸道局部免疫反應(yīng)，從而增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫能力，防止致病菌或毒素在體內(nèi)造成損害［18－19］。

3.4 不同營養(yǎng)水平下日糧中添加益生菌對腸道菌群的影響

腸道消化系統(tǒng)對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收能力部分依賴于腸道中微生物分布的種類和數(shù)量。腸道中微生物的種類和數(shù)量決定了營養(yǎng)物質(zhì)的代謝范圍和程度，它們與宿主的健康、疾病有著極其密切的聯(lián)系。當(dāng)腸道微生態(tài)系統(tǒng)受到環(huán)境變化、采食、應(yīng)激等因素的影響，其有益菌衍生的有益作用不能滿足動物的生長要求，導(dǎo)致腸道功能發(fā)生紊亂，引起疾病的發(fā)生。而添加益生菌能有效調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系的種類，促進(jìn)腸道有益菌增殖，同時可與有害微生物進(jìn)行競爭，維持和調(diào)整腸道微生態(tài)平衡［20－21］。孫瑞鋒等［22］研究表明，添加枯草芽孢桿菌可降低21 d大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量，增加乳酸桿菌數(shù)量，從而調(diào)節(jié)肉雞腸道微生態(tài)環(huán)境。本試驗中，在不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌能極顯著提高21 d肉雞回腸的乳酸桿菌數(shù)量，降低21 d、42 d回腸大腸桿菌數(shù)量，但日糧營養(yǎng)水平則對腸道菌群影響不大，這提示益生菌在低營養(yǎng)水平日糧中也能發(fā)揮其抑制病原微生物、促進(jìn)有益菌增殖的作用，其可能機(jī)制是:益生菌與腸道有益菌協(xié)同，通過有氧發(fā)酵，維持腸道的厭氧環(huán)境，從而排斥有害菌;益生菌在代謝過程中產(chǎn)生一些抗菌物質(zhì)，能直接殺滅致病菌［23］;益生菌能清除腸道內(nèi)的毒性胺、硫化物、酚類和吲哚等，減少有害菌的代謝底物。但益生菌抑制有害菌、促進(jìn)有益菌增殖的具體作用機(jī)理及其與機(jī)體有益菌的協(xié)同效應(yīng)尚需更深入的探究。

4 結(jié)論

4.1 益生菌在不同營養(yǎng)水平下均能改善肉雞的免疫功能和抗氧化性能，促進(jìn)有益菌的增殖。

4.2 在低營養(yǎng)水平下添加益生菌能促進(jìn)肉雞前期的免疫器官生長和發(fā)育，促進(jìn)腸黏膜免疫球蛋白分泌，極顯著促進(jìn)21 d回腸乳酸桿菌的增殖，抑制大腸桿菌增殖。

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