王 濤，裴復陽，王 琪，王鶯燕

(1.大連大學附屬中山醫(yī)院呼吸內科，遼寧 大連 116001;2.大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 呼吸內科，遼寧 大連 116027;3.大連醫(yī)科大學 診斷教研室，遼寧大連 116044)

Sorcin蛋白高表達與肺癌細胞株NCI-H446多藥耐藥的關系

王 濤1，裴復陽1，王 琪2，王鶯燕3

(1.大連大學附屬中山醫(yī)院呼吸內科，遼寧 大連 116001;2.大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 呼吸內科，遼寧 大連 116027;3.大連醫(yī)科大學 診斷教研室，遼寧大連 116044)

目的 探討Sorcin高表達與肺癌細胞NCI-H446多藥耐藥的相關性。方法 研究對象為肺癌細胞NCI-H446，以順鉑為誘導藥物，建立多藥耐藥細胞系NCI-H446/CDDP;應用反義核酸技術抑制NCI-H446/CDDP細胞Sorcin的表達建立轉染細胞，為反義核酸組，同時設空白對照組。通過RT-PCR及Western-blot分別檢測各組細胞中Sorcin在核酸及蛋白水平的表達;MTT法測定NCI-H446組、反義核酸組、NCI-H446/CDDP組3組細胞在不同化療藥物DDP、VCR、ADM、VP-16作用下生存率;用Pearson相關分析Sorcin高表達與肺癌細胞株NCI-H446多藥耐藥的相關性。結果 各組細胞中Sorcin在核酸及蛋白水平的表達，NCI-H446/CDDP組與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)，NCI-H446組、反義核酸組、NCI-H446/CDDP組各組間比較均具有顯著性意義(P＜0.05);NCI-H446/CDDP細胞中Sorcin在核酸及蛋白水平均明顯高于NCI-H446細胞，分別為NCI-H446細胞的9.81倍和7.67倍。各組細胞在不同化療藥物作用下IC50:NCI-H446/CDDP組＞反義核酸組＞NCI-H446組，各組間比較差異具有顯著性意義(P＜0.05)。Pearson相關提示:Sorcin核酸及蛋白水平的表達與在不同化療藥物作用下各組細胞的IC50值呈負相關(P＜0.05)。結論 Sorcin蛋白的高表達與肺癌多藥耐藥相關，抑制Sorcin蛋白的表達可以逆轉肺癌多藥耐藥性。

可溶性耐藥相關鈣結合蛋白;肺癌;多藥耐藥;耐藥指數

腫瘤細胞的多藥耐藥性(multi-drug resistance，MDR)是指腫瘤細胞接觸一種化療藥物并對其產生耐藥后，同時對其他化學結構和作用機制不同的化療藥物亦產生耐藥［1］。肺癌是全球性的惡性疾病，其發(fā)病及死亡率在世界范圍的腫瘤性疾病中居首位，化療是肺癌的主要治療方法，但是肺癌對多種化療藥物產生耐藥常常導致治療失?。?］。肺癌耐藥機制比較復雜，因此迫切需要探明耐藥機制，通過各種途徑逆轉其耐藥性。很多研究表明，可溶性耐藥相關鈣結合蛋白 (Sorcin)是一種胞漿蛋白，與腫瘤的多藥耐藥關系非常密切，目前對其研究主要集中在胃癌與血液系統(tǒng)腫瘤方面［3-4］，對其與肺癌多藥耐藥關系的研究頗少。本研究旨在通過RT-PCR及Western-blot分別檢測NCI-H446細胞及多藥耐藥細胞NCI-H446/CDDP中Sorcin在核酸及蛋白水平的表達水平，觀察應用反義核酸技術抑制NCI-H446/CDDP細胞Sorcin的表達后耐藥情況的變化，探討Sorcin在肺癌細胞多藥耐藥中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象及試劑

人小細胞肺癌(SCLC)細胞株NCI-H446購于中科院上海細胞所細胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基、優(yōu)等胎牛血清和精制小牛血清(Hyclone產品);二甲基四氮唑蘭(MTT)(Bebco公司產品);二甲基亞砜(DMSO)、DDP、5-FU、VCR、ADM 和 VP -16(Sigma公司產品);RT-PCR試劑盒、DNA Marker DL2000(Takara產品)，羊抗人Sorcin一抗抗體、羊抗人βactin抗體、HRP-兔抗羊IgG(Santa Cruz公司)。

1.2 方 法

1.2.1 多藥耐藥細胞系NCI-H446/CDDP的誘導建立:以人SCLC細胞株NCI-H446為誘導對象，順鉑為誘導藥物，采用首次大劑量沖擊和逐步增加劑量結合的方式，最終建立人SCLC多藥耐藥細胞系NCI-H446/CDDP。該耐藥細胞系能在含有0.5 μg/mL順鉑的RPMI1640培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長和傳代。

1.2.2 Sorcin 反義核苷酸轉染 NCI- H446/CDDP細胞:采用Sorcin反義核苷酸(antisenseoligonucleotides，ASO)抑制Sorcin在NCI-H446/CDDP的表達。反義核酸序列參照文獻［6］，反義核酸序列為5’-TACGCCATGCTGCAGACTGC-3’與 Sorcin翻譯起始區(qū)互補。反義核酸序列經GenBank比對，與已知任何哺乳動物基因無匹配。硫代修飾的Sorcin反義核酸由TaKaRa公司合成。按脂質體轉染試劑盒(Lipofectamine2000)說明轉染反義核酸至 NCIH446/CDDP細胞。并設脂質體(oligofect-amine)為空白對照組。

1.2.3 細胞分組:將細胞分為4組:NCI-H446組、反義核酸組、空白對照組、NCI-H446/CDDP組。

1.2.4 RNA提取以及RT-PCR:按試劑盒說明分別提取各組細胞的總RNA，制備cDNA，進行PCR產物擴增。Sorcin引物由上海生工公司合成。引物設計參照文獻［3］，上游引物:5’AAAAGATCTATGGCGTACCGGGGCAT 3’;下游引物:5’GGGTCTAGATTAAACA CTCATGACACATTG 3’;內參β-actin上游引物序列為5’CTACAATGAGCTGCGTGTGGC 3’，下游引物序列為 5’GAGGTCCAGACGCAGGATGGC 3’。取 PCR擴增產物10 μL，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，用美國UVP凝膠成像系統(tǒng)EC3System進行掃描分析，計算公式為:某樣品Sorcin mRNA的相對表達水平=樣品Sorcin的IOD值/樣品β-actin的IOD值。

1.2.5 蛋白提取及Western雜交:將細胞置于1.5 mL Eppendorf管中，加入 RIPA 緩沖液 300 μL，以12 000 r/min速度、4℃離心10 min，將上清轉移至新管，再重復離心2次，-70℃保存;使用Bradford比色法測定蛋白含量，依次進行SDS-PAGE、電轉印。取下轉印好的PVDF膜，放入封閉液中4℃封閉過夜，加入稀釋的羊抗人Sorcin一抗抗體(一抗，1∶200)及羊抗人 β -actin(一抗，1∶400)，37℃孵育1 h，PBST洗膜3次，5 min/次。再加入稀釋的辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG(二抗，1∶5 000)，37℃孵育1 h，PBST洗膜3次，5 min/次，在室溫進行ECL顯色。用美國UVP公司EC3 System凝膠成像系統(tǒng)對PVDF膜進行掃描分析，計算公式為:樣品Sorcin蛋白的相對表達水平=樣品Sorcin的IOD值/樣品β-actin的IOD值。

1.2.6 體外藥物敏感性實驗:采用 MTT法檢測NCI-H446組、反義核酸組、NCI-H446/CDDP組細胞對DDP、VCR、ADM和VP-16的藥物敏感性。將細胞以1×105/mL的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，200 μL/孔，培養(yǎng)24 h后加入生理鹽水稀釋的不同濃度的各種化療藥物，共同作用24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，再培養(yǎng)4 h后，離心去除培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜 150 μL，用震蕩器震蕩10 min，在全自動酶標儀上選擇波長570 nm測定吸光值(A值)，比色時空白孔調零，全部實驗重復3次，取平均值。根據A值計算細胞存活率(vitalrate，VR)，計算公式為:細胞存活率(%)=用藥組A值/對照組A值×100%。根據各藥物VR，由藥物濃度的對數值與VR線性回歸求出各藥物的半數抑制率(IC50)。計算耐藥指數(resistant index，RI)，RI=IC50實驗組/IC50對照組［5］。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有實驗均重復3次以上，實驗數據用MEAN±SD表示，采用 SPSS 12.0軟件處理，用單向方差分析比較多組間均數的差異，用Pearson相關分析Sorcin高表達與肺癌細胞株NCI-H446多藥耐藥的相關性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Sorcin核酸水平的表達

RT-PCR結果顯示:各組細胞Sorcin mRNA的相對表達量如圖1所示，NCI-H446組、反義核酸組、空白對照組和NCI-H446/CDDP組的 SorcinmRNA 表達水平分別為:0.094 ±0.001、0.441 ±0.031、0.814 ± 0.036 和 0.923 ± 0.012。NCI -H446/CDDP組與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05);NCI-H446組、反義核酸組、NCIH446/CDDP組各組間比較差異均具有顯著性意義(P＜0.05)。NCI-H446/CDDP組及反義核酸組分別為NCI-H446組的9.81倍及4.69倍。

2.2 Sorcin蛋白水平的表達

Western-blot結果顯示如圖2:與核酸表達一樣，NCI-H446/CDDP組Sorcin蛋白的表達最高，反義核酸組次之，NCI-H446組最低，分別為:0.943±0.024、0.357 ±0.023、0.123 ±0.021，各組間比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。NCI-H446/CDDP組及反義核酸組分別為NCI-H446組的7.67倍及2.9倍。空白對照組Sorcin蛋白的表達為0.874±0.017與NCI-H446/CDDP組比較，差異無顯著性意義(P ＞0.05)。

圖1 不同組細胞Sorcin核酸水平的表達Fig 1 Expression of Sorcin mRNA in different cell group

圖2 不同組細胞Sorcin蛋白水平的表達Fig 2 Expression of Sorcin protein in different cell group

2.3 各組細胞的藥物敏感性測定

MTT法檢測3組細胞:NCI-H446組、反義核酸組、NCI-H446/CDDP組在不同化療藥物DDP、5-FU、VCR、ADR和VP-16作用下的敏感性如表1。各組細胞IC50:NCI-H446/CDDP組＞反義核酸組＞NCI-H446組，各組間比較，差異均具有顯著性意義(P ＜0.05)。

表1 3組細胞在不同化療藥作用下的IC50值Tab 1 The IC50of three cell group in different chemotherapy drugs

2.4 Pearson相關

Sorcin mRNA及蛋白表達與不同化療藥物作用下各組細胞的IC50值之間呈負相關(P＜0.05)，見表2。

表2 Sorcin mRNA及蛋白表達與在不同化療藥物作用下細胞IC50值之間的相關系數Tab 2 Correlation coefficient between the expression of sorcin in mRNA and protein in IC50of the group cells in different chemotherapy drugs

3 討論

肺癌已經成為全世界最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤相關死亡原因中占第1位?；熓欠伟┑闹饕委煼椒?，但是由于肺癌對許多化療藥物產生耐藥常常導致化療失敗。肺癌的耐藥機制比較復雜，一般可分為內源性和獲得性耐藥。因此迫切需要探明肺癌耐藥機制，通過各種途徑逆轉其耐藥性。

腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細胞對某種化療藥物產生耐藥性的同時，對其他結構上無關，作用靶點不同、作用機制亦各異的藥物也產生交叉耐藥性，這是一種獨特的廣譜耐藥現象。近年來，MDR形成機制已成為國內外學者研究的熱點之一。已經發(fā)現的耐藥相關蛋白有P170糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白、肺耐藥蛋白、拓撲異構酶、蛋白激酶C、乳腺癌耐藥相關蛋白及超氧化酶歧化酶等。但以往研究結果都不能完全解釋腫瘤多藥耐藥現象［6］。因此，有必要采用新方法和技術開展腫瘤多藥耐藥性研究。

可溶性耐藥相關鈣結合蛋白(Sorcin)是一種胞漿蛋白，具有典型的“E-F hand”鈣結合位點，廣泛分布于正常組織，其中心肌組織含量最為豐富［7］。1981年Meyers等［8］首次從長春新堿誘導的中國倉鼠多藥耐藥細胞株DC-3F/VCRd-5中發(fā)現了這種高表達的胞漿蛋白(PI=5.7)。研究發(fā)現Sorcin能在50%以上多種藥物篩選的多藥耐藥細胞中大量表達。Lee［9］建立了耐長春新堿(VCR)的淋巴瘤耐藥株HOB1/VCR，Southern檢測發(fā)現僅在高濃度的VCR作用下才有Sorcin基因的擴增，且Sorcin基因不隨mdr1基因的擴增而擴增，故認為Sorcin基因的擴增和mRNA的表達是在高濃度VCR作用下產生的，其研究結果也提示Sorcin與mdr1相關性不高，很可能在多藥耐藥性產生中單獨起作用。Parekh HK等［10］將Sorcin基因cDNA轉染卵巢癌細胞株和乳腺癌細胞株，誘導出了對紫杉酚的低水平抗藥性，雖然Sorcin基因的轉染沒有誘導出高水平的抗藥性，但這是Sorcin參與多藥耐藥性形成的有力證據。Sorcin與腫瘤的多藥耐藥關系非常密切，目前主要集中在胃癌與血液系統(tǒng)腫瘤方面［2-3］，但是對Sorcin與肺癌多藥耐藥關系的研究頗少。本實驗研究結果顯示:NCI-H446/CDDP細胞Sorcin在核酸及蛋白水平的表達明顯高于NCI-H446細胞，相應的NCI-H446/CDDP細胞對不同化療藥物的IC50值亦明顯高于NCI-H446細胞;應用反義核酸技術抑制NCI-H446/CDDP細胞Sorcin的表達后細胞對不同化療藥物的IC50值降低;Pearson相關提示:Sorcin核酸及蛋白水平的表達與在不同化療藥物作用下各組細胞的IC50值呈負相關，表明Sorcin的表達與肺癌多藥耐藥有關，抑制其表達可望成為提高肺癌化療效果的新手段。

:

［1］Szabo D，Keyzer H，Kaiser HE，et al.Reversal of multidrug resistance of tumor cells［J］.Anticancer Res，2000，20(6B):4261-4274.

［2］楊朝陽，陳公琰.肺癌化療耐藥機制的研究進展［J］.實用腫瘤學雜志，2005，19(6):465 -469.

［3］易紅，楊軼軒，湯參娥，等.Sorcin蛋白質高表達與胃癌細胞多藥耐藥的關系［J］.中南大學學報:醫(yī)學版，2006，6，31(3):340 -344，349.

［4］李光耀，譚耀紅，楊純正，等.白血病患者可溶性耐藥相關鈣結合蛋白基因的表達及其臨床意義［J］.中華血液學雜志，2002，23(6):293 -296.

［5］趙云峰，宋加.A549/TaxR多藥耐藥細胞系的建立［J］.曲阜師范大學學報，2008，34(3):101 -104.

［6］左翠云，劉超.肺癌多藥耐藥相關基因的研究［J］.臨床肺科雜志，2009，14(9):1207 -1209.

［7］Xie X，Dwyer MD，Swenson L，et al.Crystal structure of calcium-free human sorcin:a member of the penta-EF-hand protein family［J］.Protein Sci，2001，10(12):2419 -2425.

［8］Meyers MB.Sorcin:a calcium - binding protein overproduced in many multidrug—resistant cells［A］.Smith V L，Dedman J R.Stimulus response coupling:the role of intracellular calcium -binding proteins［M］.Boca Raton:CRC Press，1990:159 -171.

［9］Lee WP.Purification，cDNA cloning，and expression of human sorcin in vincristine-resistant HOB1 lymphoma cell line［J］.Arch Biochem Biophys，1996，325(2):217 -226.

［10］Parekh HK，Deng H B，Choudhary K，et al.Overexpression of sorcin，a calcium-binding protein，induces a low level of paclitaxel resistance in human ovarian and breast cancer cell［J］.Biochem Pharmacol，2002，62(6):1149-1158.

Relationship of Sorcin over-expression to multidrug resistance of human lung cancer cell line NCI-H446

WANG Tao1，PEI Fu -yang1，WANG Qi2，WANG Ying-yan3
(1.Department of Respiratory Medicine，Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian116001，China;2.Department of Respiratory Medicine，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China;3.Diagnostic Laboratory，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

［Abstract］ObsjectiveTo investigate the relationship of the high expression of sorcin with multidrug resistance in lung cancer cell NCI-H446.MethodsLung cancer cell NCI-H446 was object of study，set up cell line NCI-H446/CDDP through cisplatin;Using antisense nucleic acid technology inhibited the expression of sorcin in NCI- H446/CDDP cell，building antisense nucleic acid group，at same time setting up blank control group.RT-PCR and Western-blot were used to analyze the expression of sorcin at mRNA and protein levels in every cell group.MTT was used to three groups cell(NCI-H446 cell group，antisense nucleic acid group，NCI-H446/CDDP group)survival rate in DDP，VCR，ADM，VP-16.Pearson correlation was used to analyze the correlation of the high expression of sorcin with multidrug resistance in lung cancer cell NCI-H446.ResultsComparison with the expression mRNA and protein of sorcin in every groups，the result showed:comparing NCI-H446/CDDP group with blank control group has no statistical significance(P＞0.05)，In-tercomparison in NCI-H446 cell group，antisense nucleic acid group，NCI-H446/CDDP group has statistical significance(P ＜0.05).The expression mRNA and protein of sorcin in NCI-H446/CDDP were obviously higher than it in NCIH446 cell，9.81 and 7.67 times respectively.The result of IC50:NCI- H446/CDDP group ＞ antisense nucleic acid group ＞ NCI-H446 cell group，has statistical significance(P ＜0.05).Pearson correlation to point out:the expression of sorcin in mRNA and protein was negatively correlated to IC50of the group cells in different chemotherapy drugs.ConclusionThe high expression of sorcin is related to multidrug resistance in lung cancer cell，Inhibition of its expression can reverse the drug resistance of lung cancer.

［Key words］soluble-resistance related calcium binding protein(sorcin);lung cancer;muit-drug resistance;resistance index

R734.2

A

1671-7295(2013)05-0420-04

王濤，裴復陽，王琪，等.Sorcin蛋白高表達與肺癌細胞株NCI-H446多藥耐藥的關系［J］.大連醫(yī)科大學學報，2013，35(5):420 -423，433.

10.11724/jdmu.2013.05.03

國家自然科學基金項目(30670532，81071228)

王 濤(1970-)，女，山東德州人，主治醫(yī)師，碩士研究生。E-mail:wangtao9879@hotmail.com

王 琪，教授，博士生導師。E-mail:wqdmu@yahoo.com.cn

2013-07-11;

2013-08-25)