李巍巍，任麗娜，張麗麗

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，遼寧沈陽(yáng) 110001)

縫隙連接蛋白43在子癇前期患者胎盤(pán)組織中的表達(dá)及意義

李巍巍，任麗娜，張麗麗

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，遼寧沈陽(yáng) 110001)

目的 探討縫隙連接蛋白43(Cx43)在子癇前期患者與正常妊娠婦女胎盤(pán)組織中的表達(dá)規(guī)律及其在子癇前期發(fā)病過(guò)程中可能的機(jī)制。方法 隨機(jī)選取子癇前期患者50例(輕度組20例，重度組30例)和正常妊娠孕婦50例(對(duì)照組)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對(duì)3組胎盤(pán)Cx43的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)彩色病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行定量檢測(cè)并分析。結(jié)果 Cx43在子癇前期重度組表達(dá)低于輕度組及對(duì)照組，差異均有顯著性意義(P＜0.05);輕度組與對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。Cx43在胎盤(pán)組織的表達(dá)與妊娠期高血壓疾病病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān) (r=-0.370，P＜0.05)。結(jié)論 子癇前期患者胎盤(pán)組織中縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)變化可能與子癇前期的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

子癇前期;縫隙連接蛋白43;胎盤(pán)

妊娠期高血壓疾病是妊娠期常見(jiàn)的并發(fā)癥，也是造成孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的常見(jiàn)原因之一。血管內(nèi)皮損傷是目前公認(rèn)的妊娠期高血壓疾病的重要發(fā)病機(jī)理［1］，細(xì)胞間隙連接又稱(chēng)縫隙連接，是普遍存在于人和動(dòng)物組織中的一種細(xì)胞連接形式，而細(xì)胞間隙連接異常在妊娠期高血壓疾病內(nèi)皮損傷中起重要作用［2］。Cx43是Cx基因家族中數(shù)量最為豐富的成員，迄今已發(fā)現(xiàn)存在于34種組織和46種細(xì)胞中［3］，Cx43表達(dá)及其縫隙連接功能的異常與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過(guò)程有密切的聯(lián)系［4］。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)Cx43與妊娠期高血壓疾病關(guān)系研究日漸增多，本研究采用SP法對(duì)胎盤(pán)組織進(jìn)行免疫組化，分析Cx43的定位、分布和表達(dá)量，并與正常妊娠組進(jìn)行比較，旨在探討Cx43與妊娠期高血壓疾病的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

2011年1月—2011年10月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的妊娠期高血壓疾病患者50例為疾病組，其中輕度子癇前期20例、重度子癇前期30例;妊娠期高血壓疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第7版全國(guó)統(tǒng)編教材《婦產(chǎn)科學(xué)》。以同期分娩的正常晚期妊娠孕婦50例為對(duì)照組。兩組年齡、孕周差異無(wú)顯著性意義，兩組孕婦均排除慢性高血壓、腎病、糖尿病及其他內(nèi)科合并癥。

1.2 標(biāo)本采集

胎盤(pán)娩出后直視下剪取胎盤(pán)母體面中央1.0 cm×1.0 cm×0.6 cm大小無(wú)鈣化、無(wú)機(jī)化的胎盤(pán)組織，蒸餾水沖洗血液后，10%甲醛固定12 h，石蠟包埋待檢。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

用免疫組化SP法進(jìn)行染色，操作及方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。SP免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒、兔抗鼠Cx43多克隆抗體購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司，用前均釋成1∶80的工作液，4℃冰箱保存。取石蠟切片，置烤箱60℃ 2 h以使切片緊密粘附。二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，PBS洗，3 min×3次;檸檬酸鹽抗原修復(fù)液室溫孵育20 min;3%H2O2室溫孵10 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;甩去多余液體，不洗;滴加兔抗鼠Cx43多克隆抗體，置37℃ 溫箱孵育1.5 h。0.01 mol/L PBS洗2 min×3次;滴加生物素化羊抗兔IgG，置37℃ 溫箱孵育45 min;0.01 mol/L PBS洗2 min×3次;DAB顯色，蒸餾水洗滌;蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。

1.4 結(jié)果判定

(1)陽(yáng)性表達(dá):根據(jù)染色細(xì)胞所占的比例來(lái)判斷Cx43表達(dá)的陽(yáng)性結(jié)果。在400放大倍數(shù)下，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，根據(jù)陽(yáng)性染色強(qiáng)度分為淡黃色或黃色、棕黃色和深棕黃色;無(wú)論染色強(qiáng)度如何，陽(yáng)性著色細(xì)胞比例≤10%為陰性、陽(yáng)性著色細(xì)胞比例＞10%為陽(yáng)性表達(dá)，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率 (陽(yáng)性例數(shù)/例數(shù)×100%)。(2)陽(yáng)性表達(dá)密度:采用Image-Pro-Plus圖像分析軟件系統(tǒng)對(duì)Cx43染色結(jié)果進(jìn)行分析。通過(guò)高倍顯微鏡采圖系統(tǒng)捕獲圖像，每張切片隨機(jī)采取胎盤(pán)組織10×20高倍視野圖像5個(gè)，測(cè)定不同區(qū)域陽(yáng)性染色的平均光密度值(mean optical density，MOD)，取平均值作為每張切片細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)的MOD值。所有切片均經(jīng)盲法分別由專(zhuān)人進(jìn)行免疫組化染色及觀(guān)察評(píng)估。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

對(duì)照組和疾病組孕婦胎盤(pán)組織中Cx43的表達(dá)免疫組化染色顯示，疾病組胎盤(pán)Cx43主要表達(dá)在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)照組主要表達(dá)在絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜組織中。疾病組中子癇前期輕度組胎盤(pán)Cx43染色陽(yáng)性表達(dá)為8例，子癇前期重度組4例，正常妊娠對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)為43例，妊娠期高血壓疾病組胎盤(pán)Cx43染色的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組(P＜0.05);子癇前期重度組明顯低于輕度子癇前期組(P＜0.05)。見(jiàn)表1、圖1～3。Cx43在胎盤(pán)組織的表達(dá)與妊娠期高血壓疾病病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān) (r= -0.370，P ＜0.05)。

表1 疾病組與對(duì)照組胎盤(pán)Cx43表達(dá)平均光密度均數(shù)比較Tab 1 Comparison of OD of Cx43 expression in 3 sub groups

圖1 Cx43在對(duì)照組表達(dá) (SP×100)Fig 1 Expression of Cx43 in the control group

3 討論

3.1 縫隙連接蛋白的生物學(xué)特性

圖2 Cx43在子癇前期輕度組表達(dá)(SP×100)Fig 2 Expression of Cx43 in mild pre-eclampasia group

圖3 Cx43在子癇前期重度組表達(dá)(SP×100)Fig 3 Expression of Cx43 in severe pre-eclampasia group

縫隙連接蛋白(connexin，Cx)構(gòu)成的縫隙連接(gap junction，GJ)是相鄰細(xì)胞質(zhì)膜間的一種特殊跨膜蛋白通道結(jié)構(gòu)，可進(jìn)行物質(zhì)和信息交換，參與離子和親水性小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。GJ的結(jié)構(gòu)單位為連接子(connexon)，是由6個(gè)結(jié)構(gòu)相同連接蛋白形成六聚體結(jié)構(gòu)，相鄰的細(xì)胞膜對(duì)應(yīng)面上的一對(duì)連接子組成GJ通道，可以使帶電離子和相對(duì)分子量＜1×103或直徑 ＜1.5 nm的小分子如環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、Ca2+、三磷酸肌醇(IP3)等通過(guò)［5］。GJ 通過(guò)Cx結(jié)構(gòu)和功能的變化而導(dǎo)致的細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、腫瘤、視力和聽(tīng)力障礙的發(fā)生密切相關(guān)［6］，Cx具有高度保守的氨基酸序列，不同Cx分子之間組合形成的縫隙連接通道的滲透性和導(dǎo)電性也有所不同，Cx43是Cx基因家族中數(shù)量最為豐富的成員，迄今已發(fā)現(xiàn)存在于34種組織和46種細(xì)胞中［7］。在GJ介導(dǎo)的縫隙連接通訊(gap junction intercellular communication，GJIC)方面發(fā)揮著重要的作用。

3.2 縫隙連接與細(xì)胞凋亡

縫隙連接是相鄰細(xì)胞間的唯一通道，它使細(xì)胞漿與相鄰的細(xì)胞相耦聯(lián)。它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和發(fā)育。但是近年來(lái)研究表明它在細(xì)胞凋亡(apoptosis)和存活方面起著非常重要的作用［8］。GJ介導(dǎo)細(xì)胞凋亡可以通過(guò)以下2種途徑:(1)信號(hào)分子能夠通過(guò)相鄰的兩個(gè)細(xì)胞的GJ通道直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡;(2)構(gòu)成GJ的連接蛋白可以不依賴(lài)GJ通道而直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.3 妊娠期高血壓疾病與細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，與個(gè)體的形成有著密切的關(guān)系。機(jī)體的正常發(fā)育有賴(lài)于細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，胎盤(pán)是母體與胎兒的物質(zhì)交換器官，對(duì)妊娠的維持有著重要作用，胎盤(pán)細(xì)胞增殖、凋亡的平衡是胎盤(pán)發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，細(xì)胞凋亡失調(diào)將導(dǎo)致病理妊娠如妊娠期高血壓疾病。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠高血壓患者胎盤(pán)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞的凋亡數(shù)量均明顯高于正常妊娠組，說(shuō)明細(xì)胞凋亡參與了胎盤(pán)的生長(zhǎng)發(fā)育與代謝［9］。妊高征孕婦胎盤(pán)細(xì)胞凋亡顯著增加。DiFederico等［10］認(rèn)為妊娠期高血壓疾病病理生理變化與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

本研究免疫組化結(jié)果表明:妊娠期高血壓疾病組中子癇前期輕度組胎盤(pán)Cx43染色陽(yáng)性表達(dá)為8例，子癇組4例，正常妊娠對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)為43例，妊娠期高血壓疾病組胎盤(pán)Cx43染色的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常妊娠組(P＜0.05)，子癇前期重度組明顯低于輕度子癇前期組(P＜0.05)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在正常妊娠組、子癇前期輕度組及子癇前期重度組患者胎盤(pán)組織中，Cx43的表達(dá)漸減少。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)妊高征與胎盤(pán)凋亡異常有關(guān)。Cx43介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］，而細(xì)胞凋亡失調(diào)將導(dǎo)致病理妊娠如妊娠期高血壓疾病。Cx43在妊娠期高血壓疾病患者胎盤(pán)中的表達(dá)明顯減少提示與胎盤(pán)免疫病理?yè)p傷即胎盤(pán)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，而胎盤(pán)免疫病理?yè)p傷程度與妊娠期高血壓疾病嚴(yán)重程度一致［10］，進(jìn)一步說(shuō)明妊娠期高血壓疾病患者胎盤(pán)Cx43表達(dá)減少是疾病加重的客觀(guān)指標(biāo)。Cx43表達(dá)與妊娠期高血壓疾病病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。

妊娠期高血壓疾病為妊娠期所特有的疾病，是造成圍產(chǎn)期孕婦和圍生兒死亡的主要原因，對(duì)妊娠期高血壓疾病的病因及發(fā)病機(jī)制的研究一直是婦產(chǎn)科領(lǐng)域的重要研究課題，本研究表明Cx43在胎盤(pán)組織的表達(dá)與妊娠期高血壓疾病病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，通過(guò)對(duì)子癇前期患者胎盤(pán)縫隙連接蛋白Cx43進(jìn)一步研究，對(duì)揭示子癇前期的發(fā)病機(jī)制可能起到一定的作用。

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Expression and significance of Connexin 43 in placenta tissue of pre-eclampsia

LI Wei- wei，REN Li- na，ZHANG Li- li
(Department of Obstetrics，the First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang110001，China)

［Abstract］ObjectiveTo investigate the expression of Connexin 43 in placenta tissue of preeclampsia and normal pregnant women，and to explore the etiology and mechanism of preeclampsia.Methods100 placentas tissues samples were obtained from 50 pre-eclampsia patients including 20 mild and 30 severe pre-eclampsia patients and 50 normal placentas tissues were enrolled from the third trimester pregnancies.Immunohistochemistry method was used to study the expression of Connexin 43 in placenta tissue Furthermore，multifunction precise color image measure system was used for quantitative analysis.ResultsThe expression of Connexin 43 in severe group was lower than that in mild group and normal group(P＜0.01).The expression in mild group was not lower than that in normal group(P＞0.05).Negative relationship between the expression of Connexin 43 in placenta tissue and severity of illness could be found with statistical significance(r=-0.370，P＜0.05).ConclusionPreeclampsia placenta tissue expression of Connexin 43 may play an important role in the pathogenesis of preeclampsia.

［Key words］preeclampsia;Connexin 43;placenta

R714.7

A

1671-7295(2013)05-0430-04

李巍巍，任麗娜，張麗麗.縫隙連接蛋白43在子癇前期患者胎盤(pán)組織中的表達(dá)及意義［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(5):430 -433.

10.11724/jdmu.2013.05.05

遼寧省教育廳基金項(xiàng)目(L2010612)

李巍巍(1971-)，女，遼寧大連人，副教授。E-mail:liweiweileiyue3@hotmail.com

2013-05-31;

2013-07-16)