袁 莉， 吳雨晨， 任驍萌， 劉學(xué)波

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100)

葒草素和異葒草素抗氧化活性及對肝癌細胞增殖的影響

袁 莉， 吳雨晨， 任驍萌， 劉學(xué)波*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100)

采用葒草素和異葒草素標準品，通過測定兩者對DPPH·、ABTS+·、H2O2、·OH自由基的清除率，脂質(zhì)過氧化，Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的牛血清蛋白(BSA)和DNA氧化損傷及BSA蛋白羰基化的抑制作用來評價二者的抗氧化活性，另外用MTT法評價了二者對人肝癌(HepG2)細胞生長的影響.結(jié)果表明，葒草素和異葒草素均可清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化、BSA和DNA氧化損傷和BSA羰基化，且一定濃度范圍內(nèi)異葒草素的抗氧化活性強于葒草素;另外葒草素和異葒草素可顯著抑制HepG2細胞增殖，并呈濃度和時間依賴性，且異葒草素的抑制率高于葒草素，說明異葒草素是優(yōu)于葒草素的有抗癌功效的天然抗氧化劑.

葒草素;異葒草素;體外抗氧化;氧化損傷;HepG2細胞

*劉學(xué)波，男，教授，主要從事營養(yǎng)與功能食品因子方面的研究.通訊作者.

活性氧(ROS)是一類性質(zhì)非?；顫姷暮跷镔|(zhì)的總稱.在需氧有機體正常代謝過程中伴隨有ROS的產(chǎn)生，它可作為信號分子維持機體的正常生理功能.機體內(nèi)ROS水平處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)機體內(nèi)ROS過量或抗氧化物質(zhì)不足時，會引起氧化應(yīng)激，損害生物大分子(如蛋白質(zhì)、核酸和脂類等)的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致機體生理和病理的改變［1］.據(jù)報道，許多重大疾病的發(fā)生與機體內(nèi)ROS水平失衡密切相關(guān)，如帕金森 、阿爾茨海默、腫瘤和肥胖等［2］.抗氧化物質(zhì)可通過阻礙自由基產(chǎn)生和干預(yù)自由基作用的方式而抑制自由基對機體的傷害，而天然抗氧化劑以其具有安全，高效和無毒副作用等優(yōu)點而備受關(guān)注［3］，所以運用天然抗氧化劑來干預(yù)氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生已成為目前功能食品研究的熱點.

葒草素(3'，4'，5，7－四羥基－8－吡喃葡萄糖基黃酮)(orientin)和異葒草素(3'，4'，5，7－四羥基－6－吡喃葡萄糖基黃酮)(isoorientin)是黃酮類物質(zhì)，互為同分異構(gòu)體，廣泛存在于苦菜、蕎麥、山楂和竹筍等［4－7］食品中.據(jù)報道，葒草素和異葒草素具有清除DPPH自由基和抗炎的作用，但二者抗氧化性能和對癌細胞活力的影響的研究還不全面［8－9］.本研究擬探討葒草素和異葒草素清除自由基、減少蛋白羰基化、預(yù)防蛋白和DNA氧化的能力及對人肝癌(HepG2)細胞活力的影響，旨在為葒草素和異葒草素在天然抗氧化劑和功能性食品領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葒草素和異葒草素結(jié)構(gòu)見圖1.

圖1 葒草素和異葒草素的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of orientin and isoorientin

葒草素和異葒草素標準品，上海永恒生物技術(shù)有限公司，純度 ＞98%;牛血清白蛋白(BSA)、2，2－二苯基－1－苦味肼基自由基(DPPH·)和 2，2－聯(lián)氮－雙(3－乙基苯并噻吡咯啉－6－磺酸)(ABTS+·)，美國Sigma 公司;Anti－DNP 和 anti－rabbit，美國 Santa Cruz公司;噻唑蘭(MTT)、2，4－二硝基苯肼(DNPH)，美國Amresco公司;DNA(pBR322)，中國碧云天生物技術(shù)研究所;人肝癌HepG2細胞株，第四軍醫(yī)大學(xué)細胞庫;RPMI－1640培養(yǎng)基和胎牛血清，中國Thermo Fisher公司.

1.2 儀器與設(shè)備

UV－1700型紫外分光光度計，日本島津公司;Model680型酶標儀，美國伯樂公司;3110型細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司;165－8001型垂直電泳槽和Chemi Doc XRS型凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 DPPH·自由基的清除實驗

參照 Faller等［10］方法并修改.50 μL 不同濃度的樣品溶液(樣品溶液終質(zhì)量濃度分別為20，40，80，100，200，400 μmol/L)與 225 μL 100 μmol/L 的DPPH－甲醇溶液避光靜置反應(yīng)30 min，后用紫外－可見分光光度計在517 nm波長下測定其吸光度.空白組用超純水代替樣品，對照組用甲醇代替DPPH·－甲醇溶液，同時用終濃度為400 μmol/L的Vc溶液的清除能力作對比.按式(1)計算樣品對DPPH·的清除率.

式(1)中:C為DPPH·的清除率，A1為實驗組的吸光度，A2為對照組的吸光度，A0為空白組的吸光度.

1.3.2 ABTS+·自由基的清除實驗

40 μL不同濃度的樣品溶液(樣品溶液終濃度分別為 1，5，10，20，40，80 μmol/L)與 200 μL ABTS工作液避光靜置反應(yīng)6 min，后用紫外－可見分光光度計在734 nm波長下測定吸光度.空白組用超純

式(2)中:C為ABTS·+的清除率，A1為實驗組的吸光度，A2為對照組的吸光度，A0為空白組的吸光度.

1.3.3 過氧化氫(H2O2)的清除實驗

參照喬德亮等［11］方法并修改.取離心管，分別加入240 μL 0.1 mol/L pH值為7.4的磷酸緩沖液、60 μL 0.04 mol/L H2O2和 100 μL 不同濃度樣品溶液(使得樣品溶液終濃度分別為0.01，0.05，0.10，0.50，1.00，5.00 μmol/L)，渦旋振蕩后，室溫放置10 min，用紫外－可見分光光度計在230 nm波長下測定其吸光度.同時設(shè)定空白組和對照組，空白組是用超純水代替樣品溶液，對照組是用超純水代替H2O2.另外，按照同樣方法測定終濃度為5 μmol/L的Vc溶液的清除能力用來對比.

按式(3)計算樣品對H2O2的清除率.水代替樣品，對照組用超純水代替ABTS工作液.同時用終濃度為80 μmol/L的Vc溶液的清除能力作對比.按式(2)計算樣品對ABTS·+的清除率.

式(3)中:C為H2O2的清除率，A1為實驗組的吸光度，A2為對照組的吸光度，A0為空白組的吸光度.

1.3.4 對羥基(·OH)自由基的清除

采用Fenton 法測定·OH 自由基［12］.50 μL 不同濃度樣品溶液(樣品溶液終濃度分別為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μmol/L)、100 μL 1.8 mmol/L FeSO4、75 μL 1.8 mmol/L 水楊酸－乙醇溶液和 5 μL 0.03%H2O237℃水浴孵育30 min后，用紫外－可見分光光度計在510 nm波長下測定其吸光度.空白組用超純水代替樣品溶液，對照組用超純水代替FeSO4、水楊酸－乙醇溶液和H2O2，同時用終濃度為20 μmol/L的Vc溶液的清除能力作對比.按式(4)計算樣品對羥基自由基(·OH)的清除率.

式(4)中:C為·OH的清除率，A1為實驗組的吸光度，A2為對照組的吸光度，A0為空白組的吸光度.

1.3.5 對脂質(zhì)過氧化的抑制實驗

參照 Tsuda等［13］方法.20 μL 脂質(zhì)體(20 mg卵磷脂，溶于5 mL 0.05 mol/L pH值為7.4的磷酸緩沖液中，充氮封口)和50 μL不同濃度的樣品溶液(樣品溶液終濃度分別為:10，100，500，1000 μmol/L)混勻后加入50 mmol/L FeSO45 μL并0.1 mmol/L pH值為7.4的磷酸緩沖液補足至體系總體積為300 μL.后37℃ 水浴溫育，40 min后，分別加入10%TCA 100 μL 和 0.8%TBA 100 μL，于 100 ℃水浴中敞蓋煮沸15 min，冷卻后與5 000 r/min離心10 min，取上清液用紫外－可見分光光度計在532 nm波長下測定其吸光度.空白組用磷酸緩沖液代替樣品溶液，對照組用磷酸緩沖液代替FeSO4溶液，同時用終濃度為1 000 μmol/L的Vc溶液的抑制能力用來對比.按式(5)計算樣品對脂質(zhì)過氧化的抑制率.

式(5)中:C為脂質(zhì)過氧化抑制率，A1為實驗組的吸光度，A2為對照組的吸光度，A0為空白組的吸光度.

1.3.6 Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA蛋白氧化損傷實驗

參照 Xiao 等［14］方法.97 μL BSA(0.6 mg/mL)蛋白溶液和1 μL葒草素或異葒草素溶液(樣品溶液終濃度分別為 0.001，0.010，0.100，1.000 mmol/L)與室溫孵育30 min，再分別加入1 μL Cu2+和H2O2，37℃水浴 90 min;同時以 97 μL BSA溶液與 1 μL甲醇溶液，2 μL PB混合液作陽性對照;以 97 μL BSA 溶液、1 μL 甲醇溶液、1 μL Cu2+和 1 μL H2O2的混合液作為陰性對照.反應(yīng)結(jié)束后，加入25 μL SDS，95℃水浴5 min，使蛋白充分變性.同體積的蛋白樣品經(jīng)10%聚丙烯凝膠電泳后，0.15%的考馬斯亮藍R－250染色30 min，脫色過夜，蛋白含量由Quantity One 4.6.2軟件分析.

1.3.7 Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA蛋白羰基化實驗

根據(jù)1.3.6方法制備蛋白樣品，經(jīng)10%聚丙烯凝膠電泳后，10 V，25 min轉(zhuǎn)印，使凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上.膜再與DNPH衍生30 min，2 mol/L HCL洗滌 3次，每次 5 min，甲醇洗滌 5次，每次5 min.5%脫脂乳室溫封閉2 h，TBST洗滌.用DNP抗體4℃孵育過夜，TBST洗滌，anti－rabbit抗體室溫孵育2 h，TBST洗滌，化學(xué)成像系統(tǒng)觀察蛋白質(zhì)羰基化的產(chǎn)生，并用Quantity One 4.6.2軟件定量分析.

1.3.8 Cu2+/H2O2誘導(dǎo)DNA氧化損傷

氧化損傷使DNA超螺旋斷裂成環(huán)形結(jié)構(gòu)，參照Jung等［15］的方法測定 DNA氧化損傷程度.DNA(pBR322)與葒草素或異葒草素(樣品溶液終濃度分別為10，50和100 μmol/L)于37℃孵育30 min，后與Cu2+/H2O2(0.1/1 mmol/L)于37℃水浴2 h.反應(yīng)體系與上樣緩沖液混合后，1%瓊脂糖以0.5×TBE 緩沖液(Tris 5.4 g，硼酸 2.75 g，EDTA 0.037 2 g，雙蒸水1 000 mL)水平電泳100 V 30 min后，用化學(xué)成像系統(tǒng)觀察DNA損傷程度，并用Quantity One 4.6.2軟件定量分析.

1.3.9 HepG2細胞活力測定

采用MTT法［16］測定細胞活力.消化收集細胞，細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL，接種到96孔板中，每孔100 μL，同時設(shè)置對照孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜.將葒草素和異葒草素分別用無血清培養(yǎng)基稀釋至20，40，80 μmol/L，加入到96孔板中，每孔100 μL，每組均設(shè) 6復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后，每孔加入 100 μL 0.5 mg/mL MTT溶液(用培養(yǎng)基稀釋)，37℃作用4 h后，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，用酶標儀于490 nm波長下測定每孔OD值.按式(6)計算細胞相對存活率:

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

全部實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003和SPSS 16.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計處理，計算標準偏差(±SE)并進行Duncan’s多重差異顯著分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 清除自由基的活性測定結(jié)果

2.1.1 DPPH·自由基的清除作用

葒草素和異葒草素對DPPH·自由基的清除作用見圖2.由圖2可見，葒草素和異葒草素均具有清除DPPH·自由基的能力，并呈濃度依賴性，隨著濃度的增加，清除率增加，當(dāng)濃度增加到一定值時，二者的清除率趨于相當(dāng). 濃度為20，40，80，100 μmol/L時，異葒草素對DPPH·自由基的清除率顯著(P≤0.01)高于相同濃度葒草素的清除率，分別高于28.03%，46.32%，73.23%和85.59%，說明異葒草素的清除能力明顯強于葒草素.當(dāng)濃度為200和400 μmol/L時，葒草素和異葒草素的清除能力無顯著差異.與400 μmol/L Vc對DPPH·自由基的清除能力顯著(P≤0.01)低于相同濃度的葒草素和異葒草素，說明異葒草素清除DPPH·自由基的能力強于葒草素，且在高濃度下，其清除能力甚至強于同等濃度Vc對DPPH·自由基清除能力.

圖2 葒草素和異葒草素對DPPH·自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of orientin and isoorientin on DPPH·radical

2.1.2 ABTS+·自由基的清除作用

葒草素和異葒草素對ABTS+·自由基的清除作用見圖3.由圖3可見，葒草素和異葒草素均具有清除ABTS+·自由基的能力，且呈濃度依賴性.在低濃度范圍內(nèi)，二者對ABTS·+自由基的清除能力沒有顯著差異，當(dāng)濃度為20，40 μmol/L時，異葒草素對ABTS+·自由基的清除率顯著(P≤0.05)高于相同濃度葒草素的清除率，分別高于85.40%和88.08%，說明異葒草素的清除能力明顯強于葒草素.80 μmol/L Vc對ABTS+·自由基的清除能力顯著(P≤0.01)高于相同濃度的葒草素和異葒草素，說明高濃度范圍內(nèi)，異葒草素清除ABTS+·自由基的能力高于葒草素，但其清除能力仍低于同等濃度Vc的清除能力.

2.1.3 H2O2的清除作用

葒草素和異葒草素對H2O2的清除能力見圖4.由圖4可見，葒草素和異葒草素均有清除H2O2的能力，且異葒草素對H2O2的清除能力始終強于葒草素.當(dāng)濃度小于5 μmol/L時，葒草素對H2O2的清除率呈濃度依賴性.異葒草素對H2O2的清除能力整體呈濃度依賴性，濃度為 0.05，0.10，0.50，5.00 μmol/L時，異葒草素對H2O2的清除率顯著(P≤0.01)高于相同濃度葒草素的清除率，分別高于24.94%，28.14%，31.78%和28.59%.當(dāng)樣品濃度為0.01，1.00 μmol/L 時，二者對 H2O2的清除能力無顯著差異.5.00 μmol/L Vc清除H2O2的能力顯著(P≤0.01)高于相同濃度的葒草素和異葒草素，說明異葒草素清除H2O2的能力強于葒草素，但仍低于同濃度Vc對H2O2的清除能力.

圖3 葒草素和異葒草素對ABTS+·自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of orientin and isoorientin on ABTS+·radical

2.1.4 ·OH自由基的清除作用

葒草素和異葒草素對·OH自由基的清除能力見圖5.由圖5可以看出，葒草素和異葒草素均具清除·OH自由基的能力，且分別在10 μmol/L和0.5 μmol/L時達到最大清除能力.低濃度范圍內(nèi)，異葒草素對·OH自由基的清除能力高于葒草素，當(dāng)濃度為0.5 μmol/L時，異葒草素對·OH自由基的清除率較葒草素高21.29%(P≤0.01).20 μmol/L Vc清除·OH 自由基的能力顯著(P≤0.01)低于同濃度下葒草素對·OH自由基的作用，而高于同濃度下異葒草素的作用.

2.2 保護大分子氧化損傷的活性測定結(jié)果

2.2.1 脂質(zhì)過氧化的抑制作用

圖5 葒草素和異葒草素對·OH自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of orientin and isoorientin on·OH radical

葒草素和異葒草素對脂質(zhì)過氧化的抑制作用見圖6.由圖6可見，葒草素和異葒草素都具有抑制脂質(zhì)過氧化的能力，并呈濃度依賴性.濃度為100，1 000 μmol/L時，異葒草素對脂質(zhì)過氧化的抑制率顯著(P≤0.01)高于相同濃度葒草素的抑制率，分別高于30.45%，58.84%. 當(dāng)濃度為10，500 μmol/L時，葒草素和異葒草素的抑制能力無顯著差異.1 000 μmol/L Vc抑制脂質(zhì)過氧化的能力顯著(P≤0.01)高于各濃度的葒草素和異葒草素，說明Vc抑制脂質(zhì)過氧化的能力均強于葒草素和異葒草素，而異葒草素抑制脂質(zhì)過氧化的能力強于葒草素.0.01，0.1，1 mmol/L時，異葒草素對 BSA的保護作用顯著(P≤0.01)高于相同濃度的葒草素，分別高于 66.68% ，64.76% ，58.45% ，62.60%.

圖7 葒草素和異葒草素對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的BSA氧化損傷的保護作用Fig.7 Protective effect of orientin and isoorientin on Cu2+/H2O2－induced BSA oxidative damage

圖6 葒草素和異葒草素對脂質(zhì)過氧化的清除率Fig.6 Scavenging rate of orientin and isoorientin on lipid oxidation

2.2.2 Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的牛血清蛋白氧化損傷的保護作用

葒草素和異葒草素對BSA氧化損傷的保護作用見圖7.由圖7可見，葒草素和異葒草素均具有抑制BSA氧化損傷的能力，并呈濃度依賴性，且異葒草素的保護作用強于葒草素.當(dāng)樣品濃度為0.001，

2.2.3 Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的BSA蛋白羰基化的抑制作用

葒草素和異葒草素對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的蛋白羰基化的抑制情況見圖8.由圖8中可以看出，葒草素和異葒草素都具有抑制蛋白羰基化的能力，并呈濃度依賴性，即隨著濃度的增加，對于蛋白羰基化的抑制作用越強，且異葒草素的抑制作用強于葒草素.當(dāng)樣品濃度為 0.1，0.5，1，5 mmol/L 時，異葒草素對蛋白羰基化的抑制作用顯著(P≤0.01)高于相同濃度的葒草素的抑制作用，分別高于1.38%，3.13%，4.32%和5.35%.

2.2.4 對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的DNA氧化損傷的保護作用

葒草素和異葒草素對DNA氧化損傷的保護作用見圖9.由圖9可見，葒草素和異葒草素均具有保護DNA氧化損傷的能力，并呈濃度依賴性，隨著濃度的增加，剩余超螺旋形DNA的百分比越多，即對DNA保護作用越強.濃度為10 μmol/L時，葒草素和異葒草素處理組的超螺旋形DNA含量與對照組沒有無顯著性差異.濃度為50 μmol/L時，葒草素和異葒草素處理組的超螺旋形DNA含量顯著(P≤0.01)多于對照組的含量，說明葒草素和異葒草素對DNA氧化損傷有保護作用.濃度為100 μmo/L時，異葒草素處理組的超螺旋形DNA含量高于相同濃度葒草素處理組的含量5.4%，具有顯著性(P≤0.01)差異.

圖8 葒草素和異葒草素對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的蛋白羰基化的抑制率Fig.8 Inhibition of orientin and isoorientin on Cu2+/H2O2－induced BSA protein carbonyls

圖9 葒草素和異葒草素對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的DNA氧化損傷的保護作用Fig.9 Inhibition of orientin and isoorientin on Cu2+/H2O2－induced BSA protein carbonyls

2.3 對HepG2細胞活力的影響

葒草素和異葒草素對HepG2細胞活力的影響見圖10.由圖10可見，葒草素和異葒草素均可降低HepG2細胞活力，并呈濃度和時間依賴性，且異葒草素效果顯著強于葒草素.80 μmol/L異葒草素處理細胞24 h和48 h時，細胞活力較同濃度葒草素處理相同時間后細胞活力分別低于16.57%，33.69%，存在顯著性(P＜0.01)差異.

圖10 葒草素和異葒草素對HepG2細胞活力的影響Fig.10 Effect of orientin and isoorientin on HepG2 cell viability

3 結(jié)論

葒草素和異葒草素可顯著的清除 DPPH·、ABTS+·、H2O2、·OH 自由基;并有效抑制 Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化、BSA氧化損傷、BSA蛋白羰基化和DNA氧化損傷;另外，葒草素和異葒草素可顯著抑制HepG2細胞生長，且異葒草素抗氧化能力和抑制癌細胞增殖的效果明顯優(yōu)于葒草素.關(guān)于葒草素和異葒草素抑制癌細胞增殖的作用機制，以及二者的其他生物功效還需進一步研究.

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Comparison of Antioxidant Activities and Cytotoxicity in HepG2 Cells of Orientin and Isoorientin

YUAN Li， WU Yu－chen， REN Xiao－meng， LIU Xue－bo*
(College of Food Science and Engineering，Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling712100，China)

In this study，the effects of orientin and isoorientin on radical－scavenging activities(DPPH·，ABTS+·，H2O2，·OH)，lipid peroxidation，Cu2+/H2O2induced BSA and DNA oxidative damage，and BSA protein carbonyls were investigated.The results showed that orientin and isoorientin exhibited high radical－scavenging activities and also effectively protected biological macromolecules including proteins，lipids，and DNA against oxidative damage induced by Cu2+/H2O2.Moreover，the MTT assay revealed that orientin and isoorientin inhibited proliferation of HepG2 cells in a dose and time dependent manner，and the antioxidant and anticancer activities of isoorientin was much better than that of orientin.These results demonstrate the remarkable potentiality of isoorientin as a valuable nature antioxidant possessing original anticancer abilities.

orientin;isoorientin;antioxidant;oxidative damage;HepG2 cells

TS201

A

2095－6002(2013)06－0021－07

袁莉，吳雨晨，任驍萌，等.葒草素和異葒草素抗氧化活性及對肝癌細胞增殖的影響.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2013，31(6):21－27.

YUAN Li，WU Yu－chen，REN Xiao－meng，et al.Comparison of Antioxidant Activities and Cytotoxicity in HepG2 Cells of Orientin and Isoorientin.Journal of Food Science and Technology，2013，31(6):21 －27.

2013－10－06

國家自然科學(xué)基金資助項目(31000757).

袁 莉，女，博士研究生，研究方向為營養(yǎng)與功能食品因子;

(責(zé)任編輯:葉紅波)