張智慧 楊紅建 任清長 金 鑫 李勝利

(中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

反芻動物小腸代謝蛋白質(zhì)由過瘤胃蛋白質(zhì)、瘤胃微生物蛋白(MCP)和內(nèi)源性蛋白質(zhì)組成。MCP合成量的高低不僅可以反映瘤胃中微生物的數(shù)量，而且能反映MCP合成的效率［1］。MCP可為宿主提供所需小腸代謝蛋白質(zhì)的40% ～60%［2］，其傳統(tǒng)測定方法主要包括內(nèi)源指示劑法(微生物核酸)和外源指示劑法(35N、15S)［3］。上述方法均需瘺管動物，而瘺管安裝本身會對動物正常生理機能產(chǎn)生一定的侵害性，不利于準確地估測MCP合成量［4-5］。Topps等［6］發(fā)現(xiàn)瘤胃 MCP 合成量與尿中嘌呤衍生物(purine derivative，PD)排出量具有線性相關(guān)性，并首次提出將尿液PD作為MCP測定的內(nèi)源性標記物。十二指腸中的核酸主要源于瘤胃中微生物體嘌呤的降解物，經(jīng)腸道消化吸收后，經(jīng)尿液以尿囊素為主排出［7］。此后，Chen等［8-9］建立了通過尿中PD排出量來估測小腸中MCP 流量的方法。González-Ronquillo等［10］研究發(fā)現(xiàn)在奶牛上應(yīng)用此方法所測定的MCP流量與外源指示劑法測定結(jié)果基本一致。尿液PD法因其對試驗動物無侵害、易操作，準確性較高而倍受青睞，其影響因素主要有動物種類、飼糧組成、飼料加工處理方法等［11］。飼糧碳水化合物在瘤胃內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生的VFA可作為MCP合成的碳架，ATP為微生物生長提供能量，是MCP合成的動力，其水平高低和來源差異可影響MCP合成。目前，我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)普遍存在優(yōu)質(zhì)飼草短缺，只有一些大型規(guī)?；鲇袟l件飼喂苜蓿、羊草等優(yōu)質(zhì)牧草。為了最大限度保持較高產(chǎn)奶量，通常做法是通過提高飼糧中精飼料比例來滿足產(chǎn)奶能量需要，但易面臨瘤胃亞急性酸中毒(SARA)等異常代謝疾病頻發(fā)風險。本試驗在高精飼料比例飼糧條件下，以玉米秸、玉米秸黃貯、全株玉米青貯為主要粗飼料原料，輔以羊草和苜蓿優(yōu)質(zhì)干草，旨在探討不同粗飼料組合全混合日糧(TMR)對泌乳奶牛瘤胃液MCP濃度24 h變化和小腸MCP流量的影響，進而從MCP合成量角度評估最低優(yōu)質(zhì)粗飼料的適宜用量。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

選用5頭體況良好，體重(543±45)kg，年齡4歲，泌乳期［(60±13)d］和日均產(chǎn)奶量［(18.47±0.77)kg］相近，安裝有大口徑瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛作為試驗動物。采用5×5拉丁方設(shè)計，分5期完成試驗，每期18 d，前15天為預(yù)試期，后3天為正試期。試驗期內(nèi)每天配制TMR，在每天07:00和19:00分2次集中飼喂，栓系飼養(yǎng)，機械擠奶(05:30和17:30)，全天自由飲水。試驗TMR精粗比為61:39，各處理粗飼料組合如下:TMR1，100% 玉米秸;TMR2，50% 玉米秸與50%玉米秸黃貯;TMR3，50%玉米秸黃貯與50%全株玉米青貯;TMR4，50%羊草與50%全株玉米青貯;TMR5，34%羊草、33%全株玉米青貯與33%苜蓿。精飼料組成見表1。試驗TMR組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.2 樣品采集與分析測定

1.2.1 瘤胃液的采集與MCP濃度測定

在正試期內(nèi)第1天01:00、07:00(晨飼)、13:00、19:00(晚 飼)，第 2 天 03:00、09:00、15:00、21:00，第 3 天 05:00、11:00、17:00、23:00采集共12個時間點的瘤胃液，每個時間點采集5頭牛瘤胃液樣品，并經(jīng)4層紗布過濾后保存于-20℃中。取1 mL瘤胃液，430×g離心5 min，去除原蟲和飼料顆粒后，參照Makkar等［12］的比色法進行MCP濃度測定。

表1 精飼料組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Concentrate composition(DM basis)%

1.2.2 尿液的采集與尿中嘌呤衍生物測定

在正試期內(nèi)，連續(xù)3 d 24 h全收尿并記錄尿量。在尿桶中預(yù)加入200 mL 10%的稀硫酸使pH＜3.0，以防止尿樣的腐敗分解，并分裝于塑料瓶中-20℃條件下貯存。將待測尿樣稀釋50倍用于尿囊素含量測定，稀釋10倍用于尿酸含量測定。參照Chen等［9］的應(yīng)用比色法在522 nm處測定尿囊素含量、尿酶法在293 nm處測定尿酸含量。PD排出量(Y，mmol/d)與嘌呤吸收量(X，mmol/d)之間的關(guān)系如下:

瘤胃液微生物氮(MN)計算式:

式中:70為每毫摩爾嘌呤所含的氮量(mg);0.83為微生物核酸嘌呤的消化率;0.116為微生物嘌呤氮與總氮的比值［9］。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng) Excel 2007整理后，采用 SAS 9.1.3統(tǒng)計軟件中GLM過程進行單因素方差分析，采用Duncan氏法和MEANS語句統(tǒng)計組間差異的顯著性。差異性顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同TMR模式下瘤胃液MCP濃度24 h變化

由表3可知，瘤胃液MCP濃度24 h不同時間點差異不顯著(P＞0.05)。在數(shù)值上，瘤胃液MCP濃度總體趨勢為:TMR3＞TMR4＞TMR2＞TMR5＞TMR1。統(tǒng)計分析表明，不同TMR間瘤胃液MCP濃度平均值差異顯著(P＜0.05)，TMR3的瘤胃液MCP濃度平均值最高(1.217 mg/mL)，與 TMR1、TMR5差異顯著(P ＜0.05)，但與TMR2、TMR4差異不顯著(P＞0.05)。

表2 試驗TMR組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of experimental TMR(DM basis) %

表3 不同TMR模式下瘤胃液MCP濃度24 h變化Table 3 The variation of rumen fluid MCP concentration in 24 hours under different TMR mg/mL

2.2 不同TMR模式下尿中氮代謝指標

由表4可知，5種試驗TMR尿排出量范圍為16.3～19.1 L/d，但不同TMR間差異不顯著(P＞0.05)。TMR1至 TMR5的尿囊素排出量，從106.64 mmol/L升高至139.45 mmol/L，占 PD排出量的 83% ～92%。TMR5與 TMR2、TMR3、TMR4差異不顯著(P＞0.05)，但與TMR1差異顯著(P＜0.05)，比TMR1增加了30.77%。TMR2、TMR3、TMR4、TMR5與 TMR1相比較，尿酸排出量依次升高了69%、108%、146%、183%，差異顯著(P＜0.05)。在數(shù)值上，TMR1至 TMR5的 PD排出量依次升高，TMR4和TMR5顯著高于TMR1和TMR2(P＜0.05)，TMR3居中。MN和 MCP合成量與PD排出量變化一致。在數(shù)值上，TMR1至TMR5的MN和MCP合成量依次升高，TMR4和TMR5顯著高于TMR1和TMR2(P＜0.05)，TMR3居中。

表4 不同TMR模式下尿中氮代謝指標Table 4 Nitrogen metabolic indices in urine under different TMR

3 討論

反芻動物經(jīng)小腸黏膜可吸收的嘌呤來源主要包括瘤胃微生物核酸、飼糧核酸和宿主體組織代謝內(nèi)源性核酸。有研究表明，瘤胃微生物體核酸含量很高(約8%)，飼糧中核酸含量很低(小于1%)且大部分在瘤胃中在微生物作用下被降解，體組織代謝內(nèi)源性核酸排出量相對穩(wěn)定，因此由前段消化道流入小腸內(nèi)被吸收的嘌呤主要來自微生物體核酸［13］。有研究表明，微生物體核酸的消化率可達85%［9］。從小腸內(nèi)壁吸收的嘌呤核苷和游離堿基中，一小部分重新合成核酸，進而合成體組織，被各種器官利用。其余大部分則被降解為尿囊素、尿酸、黃嘌呤和次黃嘌呤，并隨尿液排出體外。由于牛小腸黏膜上的黃嘌呤氧化酶活性很高，可將所有吸收的嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸后進入肝臟被代謝，而不再被體組織利用。那些被吸收的未合成體組織核酸的嘌呤則完全轉(zhuǎn)化為代謝終產(chǎn)物，即嘌呤衍生物［9］。尿中PD排出量與在小腸吸收的嘌呤量呈正相關(guān)。由于微生物體內(nèi)嘌呤量與其體內(nèi)蛋白質(zhì)含量具有一定數(shù)量比例關(guān)系，因此，可根據(jù)PD排出量計算出微生物體嘌呤吸收量，進而估計出到達小腸的MCP流量［14］。本研究中5種TMR處理尿囊素占PD排出量的83%～92%，尿酸占PD排出量的8%～17%。本研究中未檢測黃嘌呤和次黃嘌呤，這是因為奶牛體組織和血液中的黃嘌呤氧化酶活性很高，可將黃嘌呤和次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸［9］。徐萍［11］研究發(fā)現(xiàn)，中國荷斯坦成年公牛尿中尿囊素占PD排除量的比例為73% ～88%，而馬廣川［15］在研究中國荷斯坦泌乳期奶牛時發(fā)現(xiàn)，這一比例為68% ～86%。本試驗中尿囊素占PD排出量的比例高于之前報道，這可能因動物性別和所處泌乳生理階段的差異，導(dǎo)致利用外源嘌呤以及嘌呤降解酶的活性不同。

除了動物種類、年齡、性別、體重、采食量、飼喂頻率、瘤胃外流速度和瘤胃液氨態(tài)氮濃度等因素之外，反芻動物飼糧中碳水化合物通常高達60% ～70%［16-17］，飼糧精粗比、蛋白質(zhì)和碳水化合物水平和來源以及飼糧能量水平也是是影響尿中PD排出量的重要影響因子［11］。一般將碳水化合物分為結(jié)構(gòu)性碳水化合物(SC)和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(NSC)。目前，NSC和非纖維性碳水化合物(NFC)可作為反映易消化非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的指標。由于NSC測定步驟較為繁瑣，通常亦用NFC計算值代替NSC實測值。前人研究發(fā)現(xiàn)，MCP合成量的高低與飼糧中SC、NSC以及蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生能量的利用效率有關(guān)［18-19］，淀粉、果膠等NSC與SC的比例是影響MCP合成的重要因素［20］。McCarthy等［21］在泌乳奶牛上的4 ×4 拉丁方試驗以及Stokes等［18］的體外連續(xù)培養(yǎng)研究中均發(fā)現(xiàn)，當飼糧中NSC比例較高時，MCP合成量增加。在本試驗中，隨著飼糧中非纖維性碳水化合物/中性洗滌纖維(NFC/NDF)增加，到達小腸的MCP合成量增加，這可能是由于來自飼糧在瘤胃中可快速發(fā)酵的糖類和淀粉等增加造成的。本試驗TMR中精粗比相同，不同TMR間NFC/NDF的差異可以認為是粗飼料組合不同引起的。從表2中可看出，5種TMR間粗蛋白質(zhì)水平并無明顯差異，即在TMR氮供給水平無明顯差異下，隨著TMR中NFC/NDF比例升高，增加了瘤胃微生物可發(fā)酵能的利用，進而導(dǎo)致MCP合成量增加。周永康［16］在徐淮山羊上的試驗亦獲得相似結(jié)果。

Chen等［14］指出，尿中 PD排出量與瘤胃液MCP合成量高度相關(guān)，因此尿中PD排出量反映了瘤胃MCP的合成情況。本試驗中，尿囊素、尿酸和PD排出量均隨TMR中NFC/NDF比例升高而顯著升高(5種TMR中NFC/NDF分別為:1.609、1.617、1.649、2.001、2.045)并且由此估計的流入小腸的MN合成量、MCP合成量也顯著升高。統(tǒng)計分析表明，尿囊素(y=50.44x+35.58，R2=0.733)、尿酸(y=27.22x-28.77，R2=0.734)和 PD排出量(y=77.67x+6.811，R2=0.734)均與TMR中NFC/NDF存在線性正相關(guān)關(guān)系。

顏品勛［22］研究發(fā)現(xiàn)飼料類型、種類不同，瘤胃食糜外流速度亦不同。特別是對于粗飼料，飼料種類的不同(比重上的差異)與顆粒大小不同(細度上的差異)直接影響外流速度。韓興泰等［23-24］以不同飼糧飼喂牦牛時發(fā)現(xiàn)，十二指腸食糜流量隨采食量升高而升高，且牦牛采食優(yōu)質(zhì)鮮綠青草、燕麥青干草和燕麥干草時的瘤胃食糜外流速度高于采食麥秸。本試驗中瘤胃液MCP濃度隨5種TMR呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，與尿液PD法估計的小腸MCP流量有所差異，這可能與瘤胃食糜外流速度有關(guān)。后2種TMR中青貯與苜蓿和羊草優(yōu)質(zhì)干草的加入使得適口性增加，5種TMR 的 采食量分 別為 19.37、19.58、19.86、19.96、19.97 kg/d［25］，采食量升高可能導(dǎo)致從瘤胃中流入小腸的MCP流量隨之增加。

4 結(jié)論

①在高精飼料條件下，玉米秸黃貯、全株玉米青貯搭配或替代玉米秸稈飼喂泌乳奶?？稍谝欢ǔ潭壬咸岣吣膛Ｄ蛑蠵D排出量、流入小腸的MN和MCP合成量，但沒有與羊草、苜蓿這類優(yōu)質(zhì)粗飼料組合效果顯著，即羊草+青貯+苜蓿＞羊草+青貯＞黃貯+羊草＞玉米秸+黃貯＞玉米秸。

②由尿液PD法估計的流入小腸的MCP合成量與瘤胃液中的MCP濃度存在差異，提示不能單一用瘤胃液MCP濃度評定MCP合成情況，應(yīng)結(jié)合小腸MCP測定技術(shù)或估測方法。

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