付立波 (長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130032)

在缺血、缺氧和血流灌注不足的情況下，大腦中的腺苷濃度迅速上升，內(nèi)源性腺苷對代謝增加和能量不足所引起的組織損傷具有保護(hù)作用，對睡眠具有促進(jìn)作用。抑制中縫背核(DRN)的5-羥色胺(5-HT)能神經(jīng)元，5-HT釋放減少，c-fos蛋白表達(dá)增加，也能促進(jìn)睡眠。許多睡眠因子，如IL-1，褪黑素等都能促進(jìn)睡眠，使CNS內(nèi)c-fos蛋白及c-fos mRNA表達(dá)水平提高〔1～3〕。c-fos誘導(dǎo)及顯示技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)和功能相結(jié)合的研究中受到了廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)擬明確腺苷對大鼠中縫背核c-fos表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 采用200～250 g雄性純種Wistar大鼠20只，由吉林大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，每天對大鼠進(jìn)行3次抓拿訓(xùn)練，進(jìn)行1 w的訓(xùn)練，以減少大鼠對抓拿反應(yīng)的影響。隨機(jī)分三組，每組6只(n=6)，即生理鹽水組(對照組)、腺苷組和茶堿組。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 腺苷、茶堿、生理鹽水、戊巴比妥鈉、4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS 500 ml、石蠟、LKBⅢ型超薄切片機(jī)、氧化酶阻斷劑、非免疫動物血清、氧化酶阻斷溶液、兔抗人c-fos多克隆抗體、50 μl生物素、50 μl鏈霉菌抗生物素中性樹膠、蘇木素、梯度酒精、二甲苯、新配制的DAB溶液，所有藥品均由Sigma公司提供。

1.3 裝片制備 將分組后的大鼠分別注入藥劑，注入時間為1 h，時間一到，立即將大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，斷頭，隨即開胸，經(jīng)左心室灌注生理鹽水100 ml，繼以灌注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS 500 ml進(jìn)行固定，60 min后取出腦組織，置于含4%多聚甲醛的PBS(0.1 mol/L)中后固定2天，取相應(yīng)中縫背核的腦組織塊，用石蠟包埋，修塊，并用LKBⅢ型超薄切片機(jī)切成5～8 μm切片。

1.4 Fos免疫組織化學(xué)染色(ABC法) 將石蠟切片脫蠟和水化，之后用PBS(0.01 mol/L，pH7.4)沖洗3次，每次3 min。接著在每張切片上加一滴過氧化酶阻斷劑(試劑A液)，即用抗原修復(fù)液對組織抗原進(jìn)行修復(fù)，室溫下孵育15 min。取出切片，每張切片加50μl過氧化酶阻斷溶液(抗體)，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min。甩去PBS液，每張切片加50 μl正常非免疫動物血清(試劑B液)，室溫下孵育3 min。除去血清，每張切片加50 μl的兔抗人c-fos多克隆抗體，4℃過夜。PBS沖洗3次，每次3～5 min。除去PBS液，每張切片加50 μl生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加50 μl鏈霉菌抗生物素-過氧化酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加100 μl新配制的 DAB溶液，觀察3～10 min。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS沖洗返藍(lán)。切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.5 結(jié)果判斷及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 細(xì)胞質(zhì)中有紅色顆粒者為陽性細(xì)胞，每只大鼠隨機(jī)取5張切片，在400倍鏡下計(jì)數(shù)核團(tuán)內(nèi)一個視野的Fos免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元(fos-like)的數(shù)量，取其平均數(shù)。在觀察切片時，每張切片計(jì)數(shù)3個高倍鏡視野，計(jì)算平均百分?jǐn)?shù)及標(biāo)準(zhǔn)數(shù)，結(jié)果以±s表示，兩組間均數(shù)用配對樣品t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

大鼠腹腔內(nèi)注入腺苷后，中縫背核內(nèi)c-fos蛋白表達(dá)為3.75% ±0.95%，而對照組c-fos蛋白表達(dá)為0.40% ±0.30%，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);腹腔內(nèi)注入茶堿后中縫背核內(nèi)c-fos蛋白表達(dá)為1.56% ±0.45%，與對照組c-fos蛋白表達(dá)無顯著差異(P＞0.05);腹腔內(nèi)注入腺苷組c-fos蛋白表達(dá)與腹腔內(nèi)注入茶堿組c-fos蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明大鼠腹腔內(nèi)注入腺苷后c-fos蛋白表達(dá)明顯增加，注入茶堿后c-fos蛋白表達(dá)增加不明顯，即腺苷促進(jìn)c-fos蛋白表達(dá)。見圖1。

圖1 大鼠腹腔分別注射腺苷、茶堿及生理鹽水中縫背核內(nèi)c-fos蛋白的表達(dá)(DAB，×400)

3 討論

腺苷是一種抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)，內(nèi)生腺苷在外周可抑制控制肌肉運(yùn)動的神經(jīng)元釋放乙酰膽堿，抑制交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素。其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用包括:調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸、多巴胺、5-羥色氨、去甲腎上腺素、GABA等的釋放和降解，增強(qiáng)GABA的抑制功能，抑制大腦皮層中谷氨酸及多巴胺的興奮等。另外，多例動物實(shí)驗(yàn)〔4～6〕已證實(shí)腺苷及其類似物還可以產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用及誘發(fā)睡眠。腺苷促進(jìn)睡眠作用主要是由腺苷受體A1R、A2AR介導(dǎo)的〔7〕。腺苷A1R被腺苷激活后抑制Ca2+內(nèi)流，開放鉀通道，增加K+的電導(dǎo)從而減少了興奮性氨基酸的釋放，限制了膜的去極化，抑制了神經(jīng)元的興奮，導(dǎo)致抑制效應(yīng)，有時A2AR也可能參與這個過程。根據(jù)Li等〔8〕的研究報(bào)道可以知道腺苷通過與腺苷A1受體結(jié)合，經(jīng)過鈣離子依賴的蛋白激酶C轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制GABA神經(jīng)元，GABA的釋放減少，c-fos蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)睡眠。腺苷與A2A受體結(jié)合，可興奮神經(jīng)元。腺苷是內(nèi)源性促睡眠物質(zhì)之一，具有睡眠調(diào)節(jié)作用，微透析研究發(fā)現(xiàn)前列腺素D2能升高睡眠促進(jìn)區(qū)細(xì)胞外腺苷的水平，腺苷與A2AR結(jié)合能促進(jìn)c-fos蛋白表達(dá)，可介導(dǎo)前列腺素D2的睡眠誘導(dǎo)作用〔9〕。中縫背核是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中富含5-HT能神經(jīng)元的一個重要核團(tuán)，是參與睡眠調(diào)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)。中縫背核5-HT能神經(jīng)元的活動和釋放5-HT積極地參與睡眠和覺醒的調(diào)節(jié)。5-HT是中縫背核內(nèi)影響睡眠的因子，是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與睡眠調(diào)節(jié)〔10〕。電損毀中縫背核可導(dǎo)致動物失眠，適當(dāng)電刺激可使清醒動物立刻進(jìn)入睡眠狀態(tài)。抑制5-HT能神經(jīng)元的活動，5-HT釋放量減少，中縫背核內(nèi)c-fos蛋白表達(dá)增加，可以促進(jìn)睡眠。本實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔內(nèi)注射腺苷后，中縫背核內(nèi)c-fos蛋白表達(dá)也增加，且腺苷非特異受體拮抗劑茶堿具有促進(jìn)覺醒的作用，為腺苷具有促進(jìn)睡眠的作用提供了依據(jù)。

腺苷在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用廣泛，目前研究發(fā)現(xiàn)，它還與記憶和衰老、癲癇、痛覺調(diào)質(zhì)、帕金森癥、精神病樣的行為、腦內(nèi)獎賞系統(tǒng)、痛覺調(diào)節(jié)、抗焦慮等效應(yīng)有一定相關(guān)性〔11〕。

1 霍 艷，李經(jīng)菜，江 巖，等.褪黑素對小鼠視交叉上核c-fos基因表達(dá)的影響〔J〕.中國藥理通報(bào)，2000;16(3):261-4.

2 付立波，盛艷敏，付艷平，等.腺苷對大鼠視交叉上核神經(jīng)元自發(fā)放電的影響〔J〕.山東醫(yī)藥，2009;49(41):29-30.

3 付立波，王學(xué)斌，劉鳳蓮.腺苷對大鼠韁核神經(jīng)元自發(fā)放電活動及cfos蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國免疫學(xué)雜志，2010;26(2):141-5.

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10 Maitre M，Cielsielski R，Lehman NE，et al.Protective effects of adenosine and nicotinemide against audio genic seizure〔J〕.Biochenmacol，1974;23(20):2807-16.

11 Onoe H，Ueno R，F(xiàn)ujita L，et al.Prostaglandin D2，a cerebaral sleep inducing substance in monkeys〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1998;5(11):4082-6.