張振強 宋軍營 賈亞泉 李澎濤 潘彥舒 (河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 4500046)

缺血性腦病成為嚴重危害人類健康的慢性流行性疾病之一，其發(fā)病機制較為復(fù)雜。近年研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后的幾個小時內(nèi)，缺血半暗帶或梗死區(qū)周圍的神經(jīng)元死亡主要以凋亡性死亡為主，這提示了腦缺血損傷與細胞凋亡密切相關(guān)〔1〕。因此，對腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡機制及基于抗凋亡為靶點的抗腦缺血的研究成為國內(nèi)外研究的熱點。Bcl-2蛋白家族主要參與線粒體引起的凋亡途徑，Bcl-2和Bax參與了腦出血后神經(jīng)細胞的凋亡。Bcl-2通過阻斷細胞凋亡而促進細胞存活，維持細胞生存;而Bax與 Bcl-2功能相反，則誘導(dǎo)細胞凋亡。因此，Bcl-2與Bax的比值變化決定細胞的凋亡與生存〔2〕。近年來，基質(zhì)金屬酶(MMPs)，尤其是MMP-2，在缺氧缺血性腦損傷及腦水腫中所起的作用，逐漸被人們所關(guān)注。MMP-2即72kDa IV型膠原酶，由肥大的星形細胞、星形膠質(zhì)細胞、缺血的內(nèi)皮細胞和巨噬細胞等合成和分泌。其過度表達不僅能夠引起微血管的損失，而且破壞神經(jīng)細胞賴以生存的環(huán)境，并對炎癥因子發(fā)揮正反饋作用，使腦缺血后炎癥發(fā)生，加速神經(jīng)細胞凋亡〔3〕。高脂血癥和高黏滯血癥是缺血性心腦血管病的重要原因。因此，本文在高脂血癥的病理基礎(chǔ)上探討腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡及相關(guān)基因表達的機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組 實驗動物隨機分為正常組(C1)、高脂對照組(H1)、假手術(shù)組(C2)、高脂假手術(shù)組(H2)、單純腦缺血組(I3和I7)、復(fù)合腦缺血組(H+I3和H+I7)。其中對照組與假手術(shù)組每組10只;模型組設(shè)兩個時間組，分別為腦缺血手術(shù)后3 d(I3和H+I3)和7 d(I7和H+I7)，每個時間點15只動物(按預(yù)實驗死亡率25%計，保證造模成功后取材的動物數(shù))。

1.2 實驗動物模型制備 健康雄性SPF級Wistar大鼠，體重280～300 g，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號為:SCXK(京)2007-0001，質(zhì)量合格證號:0243109。高脂血癥組大鼠每天以高脂飼料(組成:3.5%膽固醇、10%豬油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、5%白糖、80.8%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)，正常對照組以清潔級正常飼料喂養(yǎng)。

大鼠以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，線栓法制作大鼠大腦中動脈缺血模型(MCAO)。動物仰臥固定，頸部正中切口，分離并暴露右側(cè)頸總動脈及頸內(nèi)、外動脈，結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈根部，由頸總動脈近分叉處剪一小口插入尼龍線(長50 mm，直徑0.26 mm，18 mm處作標記)，插入長度約(18±0.5)mm時感到有輕微阻力時停止，扎緊并固定插線，縫合皮膚。

模型制備成功后，每組各取動物5只，以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，腹主動脈取血5 ml，靜置 30 min，以 3 000 r/min，離心 15 min，取上清液，-20℃冰箱冷凍備用。每組再各取動物5只，以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，剪開胸腔，暴露出心臟，先用手術(shù)剪剪開右心耳，再用100 ml注射器進入左心室插進主動脈，先灌注生理鹽水150 ml左右，再灌注多聚甲醛400 ml左右;斷頭取出全腦，腦組織經(jīng)過常規(guī)脫水透明，制備蠟塊，備用。

1.3 神經(jīng)功能評分 對造模大鼠蘇醒后和取材前分別進行神經(jīng)功能評分。評分標準參照Longa的5級評分方法評定動物的神經(jīng)系統(tǒng)功能。0級:無體征;1級:動物左側(cè)前肢不能完全伸展;2級:左前膚癱瘓，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象;3級:肢體癱瘓，不能站立;4級:動物昏迷，無自主性活動。評分為1級到3級的動物為造模成功，入組，于相應(yīng)時間點再次評分后取材。計算方法:以各組動物造模蘇醒時、取材前兩次評分進行組間比較。

1.4 免疫組化 腦組織片按上面的時間步驟進行脫蠟脫水;3%H2O237℃孵育 10 min，阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液微波修復(fù)抗原12 min自然冷卻20 min以上;正常羊血清工作液封閉，37℃ 20 min，吸去多余液體，勿洗。兔多克隆抗體 MMP-2(1∶200)，Bcl-2(1∶200)和Bax(1∶100)4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3×5 min(用 PBS緩沖液代替一抗作陰性對照);生物素標記二抗，37℃孵育60 min，HRP標記鏈親和素孵育60 min，DAB顯色液反應(yīng)染色。蘇木精染核，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。所有結(jié)果在10倍，40倍物鏡下觀察，采用40倍物鏡拍照。采用Lmageproplus 6.0圖像分析系統(tǒng)檢測平均光密度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分結(jié)果 見表1。對各模型組造模蘇醒后及3、7 d取材前評分進行比較，各組間沒有明顯差異(P＞0.05);復(fù)合腦缺血組與單純腦缺血組在造模蘇醒后和3、7 d取材前評分差值比較，3 d時組間沒有明顯差別(P＞0.05)，7 d時組間比較差值增大，差異顯著(P＜0.05)。

表1 各組造模蘇醒后和相應(yīng)時間點取材前的神經(jīng)功能評分差異(± s，n=5)

表1 各組造模蘇醒后和相應(yīng)時間點取材前的神經(jīng)功能評分差異(± s，n=5)

與單純腦3 d組相比較:1)P＜0.05

組別 造模蘇醒后評分 取材前評分 差值C2 0 0 0 I3 2.00±0.17 1.83±0.11 0.16±0.11 I7 1.92±0.15 1.67±0.14 0.25±0.13 H2 0 0 0 H+I3 2.00±0.17 1.58±0.15 0.41±0.15 H+I7 2.08±0.19 1.42±0.15 0.67±0.141)

圖1 大鼠腦皮質(zhì)梗死邊緣區(qū)MMP-2表達(×400)

2.2 高脂血癥病理條件下腦缺血組織中MMP-2的表達變化與正常(21.77±1.51)及假手術(shù)組(30.90±1.94)相比，MMP-2在單純腦缺血組(85.93±2.47)、(70.87±3.07)、高脂血癥組(44.32±1.99)、(54.61±4.02)和復(fù)合腦缺血組(80.82±2.95)、(99.68±2.54)的表達顯著增多(P＜0.05)，與高脂血癥及高脂血癥假手術(shù)相比，復(fù)合腦缺血組的MMP-2的表達也是明顯增多的(P＜0.05)，且MMP-2在復(fù)合腦缺血7 d組的表達顯著高于在單純腦缺血組的表達。這些結(jié)果表明高脂血癥的病理條件可能對MMP-2的表達有影響，見圖1。

2.3 高脂血癥病理條件下腦缺血組織中Bcl-2和Bax的表達變化 見表2和圖2。假手術(shù)的Bcl-2和Bax表達量都很少，但是，Bcl-2和Bax在單純腦缺血、高脂血癥和復(fù)合腦缺血組均有表達，而且差異顯著(P＜0.05)。與單純腦缺血相比，復(fù)合腦缺血組的Bax的表達顯著下降(P＜0.01)，Bcl-2的下降幅度小于Bax，復(fù)合腦缺血7 d尤為顯著。因此，Bcl-2/Bax比值升高，差異顯著(P＜0.05)。這些結(jié)果說明腦缺血后神經(jīng)細胞的凋亡程度主要由Bcl-2/Bax比值變化決定，高脂血癥對腦缺血后神經(jīng)細胞的凋亡有一定的影響作用。

表2 大鼠腦皮質(zhì)梗死邊緣區(qū)Bcl-2和Bax的蛋白表達(± s，n=5)

表2 大鼠腦皮質(zhì)梗死邊緣區(qū)Bcl-2和Bax的蛋白表達(± s，n=5)

與C2組相比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01)，與 I3組相比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01;與I7組比較:5)P ＜0.05，6)P ＜0.01;與 H2組比較:7)P ＜0.05，8)P ＜0.01

組別Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax C2 14.84±1.45 18.86±2.06 1.05±0.04 I3 57.17±2.802) 86.37±3.132) 0.46±0.021)I7 77.02±4.112)3) 88.70±4.572) 0.56±0.023)H2 48.05±3.082)3)5) 44.91±3.104)6) 0.98±0.042)6)H+I3 67.72±3.172)3)5) 63.38±3.572)4)6)8) 0.61±0.031)3)7)H+I7 74.04±2.352)3)7) 53.16±3.202)4)6)7)0.73±0.021)3)5)7)

圖2 大鼠腦皮質(zhì)梗死邊緣區(qū)Bcl-2、Bax的蛋白表達(×400)

3 討論

腦缺血后缺血部位神經(jīng)元死亡的形式主要是壞死和凋亡。腦缺血時缺血中心區(qū)神經(jīng)元以壞死為主，而缺血半暗帶區(qū)則以神經(jīng)元凋亡為主要形式〔4，5〕。高脂血癥從發(fā)病機制的特點來看，一方面已經(jīng)發(fā)生了腦組織的相對缺血缺氧及炎癥反應(yīng)，另一方面引起血管損傷并激活血管內(nèi)皮細胞。這些特征與急性腦缺血的主要病理過程相似。但是，目前還不清楚缺血前腦部是否已經(jīng)激活了相應(yīng)的腦保護機制而出現(xiàn)“預(yù)處理”(pretreatment)或“預(yù)適應(yīng)”(preconditioning)效果。

腦缺血后，隨著病程進展，缺血壞死組織通過組織水解酶及炎癥細胞吞噬、消化和吸收，梗死體積縮小，神經(jīng)功能有所恢復(fù)。本實驗顯示，復(fù)合腦缺血模型組與單純腦缺血組在各時間點對比，神經(jīng)功能評分沒有顯著性差異，但缺血后7 d和3 d的差值比較，復(fù)合腦缺血模型組差值增大，差異顯著，缺血后3 d無顯著差異。復(fù)合腦缺血模型組與單純腦缺血組比較，缺血后7 d梗死體積縮小，差異顯著。結(jié)果表明，復(fù)合腦缺血在神經(jīng)功能恢復(fù)及梗死體積改善方面優(yōu)于單純腦缺血組?？赡芘c炎癥反應(yīng)在缺血不同時期表達變化有關(guān)，也可能與高脂血癥病變期誘發(fā)體內(nèi)的某些保護機制有關(guān)。

筆者的研究結(jié)果顯示，Bcl-2、Bax在伴有腦缺血模型各時間點均有高表達，復(fù)合腦缺血組和單純腦缺血組與相應(yīng)假手術(shù)組組內(nèi)比較，差異顯著(P＜0.05);復(fù)合腦缺血組與單純腦缺血組比較，表達下降，缺血后3 d、7 d組間差異顯著(P＜0.05)，Bcl-2/Bax比值升高，在缺血后7 d組間差異顯著(P＜0.05)。腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡過程中，Bcl-2/Bax比值升高，對神經(jīng)元有保護作用。復(fù)合腦缺血與單純腦缺血在梗死邊緣區(qū)神經(jīng)元凋亡較少，提示高脂血癥可能通過炎癥因子上調(diào)體內(nèi)抗凋亡基因或下調(diào)促凋亡基因的表達，或炎癥因子刺激小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞等分泌一些對缺血腦組織損傷修復(fù)作用的物質(zhì)，如MMP-2〔6〕。

炎癥細胞因子(IL-6、TNF-α)、趨化因子(MCP-1、IL-8)等可通過基因調(diào)控 Bcl-2和 Bax的蛋白，從而影響神經(jīng)元的存活〔7，8〕。而這些炎癥因子也可能在腦缺血缺氧后引起 MMP-2的活化，激活的MMP-2進而導(dǎo)致血腦屏障打開，使炎癥因子及炎癥細胞透過血腦屏障進入中樞神經(jīng)腦組織，使?jié)撛诘腗MP-9激活，加重血腦屏障的滲透性，加速了神經(jīng)元的死亡。也有研究表明MMPs能夠直接誘導(dǎo)細胞死亡，而且認為MMP-9的表達與神經(jīng)細胞的凋亡同步，參與神經(jīng)細胞的凋亡過程，但是MMP-2的表達較晚，不直接與神經(jīng)元的凋亡有關(guān)，可能參與了腦缺血后神經(jīng)細胞的修復(fù)〔9〕。筆者的研究表明腦缺血后MMP-2的表達明顯增加(P＜0.05)，MMP-2在復(fù)合腦缺血7 d組的表達也較為顯著(P＜0.05)。也有最新研究，在高脂血癥小鼠模型的缺血性微血管中，MMP-2的表達被激活，但是MMP-2激活可能加重了高脂血癥引起的血腦屏障的滲透性〔10〕。這提示了高脂血癥的基礎(chǔ)病理條件能夠影響MMP-2的表達，也提示了高脂血癥發(fā)病機制可能存在腦缺血缺氧現(xiàn)象。MMP-2表達的增加可能參與了復(fù)合腦缺血的神經(jīng)元修復(fù)，對腦組織細胞具有保護作用。因此，明確高脂血癥的發(fā)病機制及MMP-2在高脂血癥復(fù)合腦缺血的作用機制還需要做深入研究。

高脂血癥引起的中風〔11〕，其病機也主要為痰瘀互結(jié)，進而導(dǎo)致化毒損絡(luò)〔12〕。“毒損腦絡(luò)”的現(xiàn)代生物學(xué)依據(jù)主要表現(xiàn)為腦缺血后發(fā)的生物級連反應(yīng)，產(chǎn)生的大量自由基和代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)積聚成為有害的毒性物質(zhì)〔11，13〕。毒性物質(zhì)也可以損傷神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元〔14〕。這為中醫(yī)藥防治和治療高脂血癥復(fù)合腦缺血/中風提供理論依據(jù)。

總之，本研究表明復(fù)合腦缺血組與單純腦缺血組比較，在缺血7 d梗死體積縮小，神經(jīng)功能及腦組織損傷恢復(fù)較快，Bcl-2/Bax比值升高，MMP-2的表達明顯增加，可能與高脂血癥在痰瘀基礎(chǔ)上，激發(fā)機體抵抗病邪有關(guān)，也有可能是在痰瘀基礎(chǔ)上合并腦缺血后一定時間的特殊表現(xiàn)，其遠期結(jié)果尚需進一步研究。本研究為運用中醫(yī)治療中風及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了理論基礎(chǔ)。

1 Zhang C，Zu J，Shi H，et al.The effect of Ginkgo biloba extract(EGb 761)on hepatic sinusoidal endothelial cells and hepatic microcirculation in CCl4 rats〔J〕.Am J Chin Med，2004;32:(1)21-31.

2 Gross A，McDonnell JM，Korsmeyer SJ.BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis〔J〕.Genes Dev，1999;13:(15)1899-911.

3 Nordqvist AC，Smurawa H，Mathiesen T.Expression of matrix metalloproteinases 2 and 9 in meningiomas associated with different degrees of brain invasiveness and edema〔J〕.J Neurosurg 2001;95(5):839-44.

4 Charriaut-Marlangue C，Margaill I，Represa A，et al.Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia:an in situ DNA fragmentation analysis〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，1996;16(2):186-94.

5 王繼生，邱宗蔭，夏永鵬，等.茅莓總皂苷對大鼠局灶性腦缺血/再灌注后神經(jīng)細胞凋亡及相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達的影響〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2006;2:(2)224-8.

6 劉勝達.大鼠腦出血后腦組織MMP-2、MMP-9表達及其與腦水腫關(guān)系的研究〔J〕.實用心腦肺血管病雜志，2007;15(4):249-51.

7 Sriram K，O'Callaghan JP.Divergent roles for tumor necrosis factor-alpha in the brain〔J〕.J Neuroimmune Pharmacol，2007;2:(2)140-53.

8 Spranger M，Krempien S，Schwab S，et al.Superoxide dismutase activity in serum of patients with acute cerebral ischemic injury.Correlation with clinical course and infarct size〔J〕.Stroke，1997;28(12):2425-8.

9 陳大慶，張 榮，朱烈烈，等，大鼠腦出血后MMP-2、MMP-9的表達與神經(jīng)元凋亡關(guān)系的實驗研究〔J〕.福建醫(yī)藥雜志，2008;30(4):4-6.

10 ElAli A，Doeppner TR，Zechariah A，et al.Increased blood-brain barrier permeability and brain edema after focal cerebral ischemia induced by hyperlipidemia:role of lipid peroxidation and calpain-1/2，matrix metalloproteinase-2/9，and RhoA overactivation〔J〕.Stroke，2008;42(11):3238-44.

11 馮加純，張淑琴，饒明俐，等.大鼠全腦缺血再灌注后幾個腦區(qū)在不同時間的LPO、SOD、GSH-Px含量變化〔J〕.中風與神經(jīng)疾病雜志，1994;11(3):129-32.

12 祝維峰.缺血性中風痰瘀互結(jié)機制的探討〔J〕.浙江中醫(yī)雜志，2000;22(3):57-8.

13 李澎濤，王永炎，黃啟福.“毒損腦絡(luò)”病機假說的形成及其理論與實踐意義〔J〕.北京醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2001;24(1):1-6.

14 Holtzman DM，Sheldon RA，Jaffe W，et al.Nerve growth factor protects the neonatal brain against hypoxic-ischemic injury〔J〕.Ann Neurol，1996;39(1):114-22.