李學(xué)榮 李榮亨 楊敏美 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”、“尪痹”的范疇，《內(nèi)經(jīng)》里有記載:“風(fēng)寒濕之邪三氣雜至，合而為痹，其風(fēng)氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹”。歷代醫(yī)家認(rèn)為RA主要是由于正氣不足，腠理不密，衛(wèi)外不固，感受風(fēng)、寒、濕之邪氣所致，而正氣不足、肝腎虧虛是發(fā)病基礎(chǔ)〔1〕。RA具有起病較緩、病程長、纏綿難愈的特點(diǎn)，從而造成“久病多虛”、“久病多瘀”的病理過程。本研究探討復(fù)元膠囊對氣虛血瘀證類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用及其機(jī)制，為具有滋補(bǔ)肝腎、益氣活血的中藥防治氣虛血瘀證RA提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性SD大鼠60只，體重(200±20)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號:SCXK渝20020001)，適應(yīng)性喂養(yǎng)后1 w后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及用藥 牛Ⅱ型膠原(CⅡ)、完全弗氏佐劑(CFA)，均購于Sigma公司;冰醋酸、10%水合氯醛，由重慶醫(yī)科大學(xué)附一院實(shí)驗(yàn)室提供;TNF-α、IL-1β、IL-6試劑盒，購于上海源葉生物制劑公司。復(fù)元膠囊，由黃芪、生曬參、淫羊藿、枸杞子、川芎、丹參、三七等藥組成，具有滋肝補(bǔ)腎、益氣活血的功效，每粒膠囊重0.41 g，相當(dāng)于生藥2.0 g，重慶希爾安藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。MTX，2.5 mg/片，上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，批號:110804，國藥準(zhǔn)字:H31020644。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模方法 將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分空白組12只、造模組48只。參考文獻(xiàn)〔2〕方法造模。在無菌條件下，用0.1 mol/L冰醋酸充分溶解牛Ⅱ型膠原蛋白，濃度為4 mg/L，置4℃冰箱過夜后，再與等體積弗氏不完全佐劑(1 mg/ml)混合、震蕩至充分乳化，制成CⅡ乳劑，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)時(shí)于每只大鼠尾根部及左足底皮內(nèi)注射0.25 ml致炎，于14 d后按上述方法和劑量再次免疫。加強(qiáng)注射后，以大鼠四肢足爪均嚴(yán)重腫脹、踝關(guān)節(jié)直徑增長幅度≥2 mm為造模成功，造模過程中有1只老鼠死亡。第二次誘導(dǎo)注射后1 w后，將47只造模組大鼠按照文獻(xiàn)〔3〕建立氣虛血瘀證模型大鼠。方法是:①游泳:將大鼠置于涼水 (14～16℃)中游泳，疲勞時(shí)撈出水面 (疲勞標(biāo)準(zhǔn)以大鼠第一次自然下沉為度)，每日1次。②饑餓和高脂飲食:每只鼠按照大鼠體重40 g/kg標(biāo)準(zhǔn)〔4〕提供高脂飼料 (每5 kg普通飼料加豬油lkg)，每天早上8:00點(diǎn)給予全天量的2/3，晚上8:00給予全天量的1/3。③寒濕:大鼠游泳完后，放置在通風(fēng)的環(huán)境中自然晾干，不給予保溫措施和擦拭水跡。連續(xù)4 w，即出現(xiàn)精神萎頓、嗜睡、毛發(fā)枯黃脫落、輕度稀便、尾尖至根部出現(xiàn)輕度瘀血點(diǎn)等癥狀，同時(shí)隨機(jī)抽取空白組及模型組大鼠各6只，尾靜脈取血，檢測血液流變學(xué)，模型組較空白組血黏度升高(P＜0.05)，則表明造模成功。

1.3.2 分組及給藥方法 造模成功后，將47只大鼠隨機(jī)分為模型組、復(fù)元膠囊組、MTX、聯(lián)用組，模型組11只，其余每組各12只，各組之間的關(guān)節(jié)腫脹體積無顯著性差異。根據(jù)Meeh-Rubner氏公式計(jì)算給藥劑量，復(fù)元膠囊配成湯劑濃度為100 mg/ml，MTX溶液濃度為0.1 mg/ml，藥量相當(dāng)于人體用量的10倍。MTX組和聯(lián)用組每周1次灌胃給藥MTX 2.5 ml/只;復(fù)元膠囊組及聯(lián)用組每日灌胃給復(fù)元膠囊湯劑2 ml/只;空白組和模型組每日予同等劑量蒸餾水2 ml/只灌胃，連續(xù)給藥8 w。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 一般狀況 觀察大鼠的精神狀況，毛發(fā)，大便，尾部瘀斑輕重，對抗力及攻擊力，游泳及耐疲勞時(shí)間。

1.4.2 大鼠關(guān)節(jié)腫脹率 用水容積法，于首次免疫當(dāng)天檢測左足腫脹度，隔日1次，直至處死。以第1天測得關(guān)節(jié)置換水容積為基值，以后所測值與之相比值而得關(guān)節(jié)腫脹率。

1.4.3 模型組大鼠血黏度檢測 建立氣虛血瘀證模型大鼠4 w后，隨機(jī)抽取空白組及模型組大鼠各6只，尾靜脈取血約2 ml，用MVIS-2015全自動(dòng)血液流變學(xué)分析儀測定血液流變學(xué)指標(biāo)，于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科完成。

1.4.4 血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測 灌胃給藥滿8 w時(shí)，各組大鼠心臟取血約3 ml，分離血清，凍存于-20℃冰箱中待測。采用ELISA法檢測大鼠血清TNF-α，放射免疫法測定血清IL-1β、IL-6水平，方法嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析和兩兩比較 (LSD法)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 模型組與空白組大鼠比較，精神萎靡、毛發(fā)稀疏、反應(yīng)遲鈍、尾部瘀斑及關(guān)節(jié)紅腫明顯，聯(lián)用組與復(fù)元膠囊及MTX組比較，大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度輕、毛發(fā)有光澤、精神狀態(tài)好、反應(yīng)靈敏、尾部瘀斑不明顯。

2.2 模型組大鼠血液流變學(xué)變化 模型組與空白組比較，血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)均偏高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，模型組大鼠血液流變學(xué)變化。見表1。

表1 模型組大鼠血液流變學(xué)的變化(± s，n=6)

表1 模型組大鼠血液流變學(xué)的變化(± s，n=6)

與空白組相比:1)P＜0.05

組別 全血黏度高切(200/s)全血黏度中切(100/s) 全血黏度低切(3/s) 血漿黏度(mpas) 紅細(xì)胞聚集指數(shù)(Arbc)紅細(xì)胞電泳時(shí)間(s)空白組 5.78±0.23 6.37±0.21 9.88±0.15 1.32±0.12 6.67±0.42 19.89±0.53模型組 6.08±0.481) 8.89±0.171) 13.44±0.121) 1.88±0.111) 8.98±0.291) 28.33±0.281)

2.3 各組大鼠大鼠TNF-α、IL-1β及IL-6的變化 模型組與空白組比較，血清TNF-α、IL-1β及 IL-6含量均升高 (P＜0.05);復(fù)元膠囊組、MTX組及聯(lián)用組與模型組比較，血清TNF-α、IL-1β及IL-6含量均偏低 (P＜0.05);其中聯(lián)用組與甲氨蝶呤組比較，血清TNF-α、IL-1β及IL-6含量差異顯著(P＜0.05)，復(fù)元膠囊與MTX組血清TNF-α、IL-1β及IL-6含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。各組大鼠TNF-α、IL-1β及IL-6的變化。見表2。

表2 各組大鼠TNF-α、IL-1β及IL-6的變化(pg/ml，±s)

表2 各組大鼠TNF-α、IL-1β及IL-6的變化(pg/ml，±s)

與空白組比較:1)P＜0.05;與模型組相比:2)P＜0.05;與復(fù)元膠囊組比較:3)P＜0.05;與MTX組比較:4)P＜0.05

組別 n TNF-α IL-1β 12 10.47±2.61 0.08±0.012 80.23±30.23模型組 11 120.21±2.431) 0.37±0.0141)273.57±32.101)復(fù)元膠囊組 12 41.23±2.332) 0.20±0.0172)169.49±33.652)MTX組 12 40.87±2.483) 0.19±0.0323)165.45±34.143)聯(lián)用組 12 27.57±2.584) 0.12±0.0434)113.87±32.144)IL-6空白組

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為氣是有很強(qiáng)活力的精微物質(zhì)，有推動(dòng)、溫煦、防御、固攝、營養(yǎng)、中介的功能，具有生命物質(zhì)和生理功能雙重屬性?！端貑?舉痛論》說:“百病生于氣也”。氣為血之帥，氣行則血行，氣虛則無力鼓動(dòng)血液運(yùn)行，尤其是心氣不足，更易引起血行不暢，血液初起流動(dòng)緩慢，繼而瘀滯成塊，形成虛中夾實(shí)的氣虛血瘀證。

RA從發(fā)病機(jī)制及臨床特點(diǎn)來看，正氣虛弱是發(fā)生本病的根本，正氣不足，致使機(jī)體衛(wèi)外不固，腠理不密，使風(fēng)、寒、濕之邪乘虛侵襲，注于經(jīng)絡(luò)，留于關(guān)節(jié)，引發(fā)本病。另一方面則是肝腎不足，肝藏血主筋，腎藏精主骨，先天稟賦不足，或各種原因?qū)е赂文I不足，則精血虧虛，筋骨失養(yǎng)，外邪可乘虛入侵，留滯于關(guān)節(jié)而成本病〔4〕。同時(shí)內(nèi)因(氣血虧虛、肝腎不足)和外因(風(fēng)寒濕等邪)均可致瘀，而瘀血又可作為新的致病因素進(jìn)一步加重RA病情。初期外邪痹阻經(jīng)脈，氣血運(yùn)行不暢，進(jìn)而正邪交爭，氣滯血瘀，病程遷延日久，進(jìn)一步損耗正氣而致氣血虧虛，無力推動(dòng)血行，而致氣虛血瘀。可見，氣血虧虛，肝腎不足是本病發(fā)生的基礎(chǔ)，瘀血阻滯是其基本的病理特征，氣虛血瘀貫穿RA的始終?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為RA患者血漿成分存在異常，如RF、免疫球蛋白IgA、IgM、IgG以及它們的復(fù)合物、γ球蛋白或抗原抗體復(fù)合物、纖維蛋白原等，由于這些成分的增加，導(dǎo)致了血漿黏度的增加，血漿是血液的重要組成部分，由于血漿成分的增加、血漿黏度的改變、紅細(xì)胞沉降的加速、血小板數(shù)目的增加等，致血液的濃稠性、凝固性、聚集性增加，最終導(dǎo)致全血黏度增高〔5〕。血液流變學(xué)指標(biāo)的變化列為血瘀證的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一〔6〕，故在本實(shí)驗(yàn)中，建立氣虛血瘀證模型大鼠4 w后，檢測大鼠血液流變學(xué)以評價(jià)造模是否成功。由此可見，益氣活血化瘀法無論從中醫(yī)理論還是西醫(yī)病理，在RA的治療中均有其使用的理論依據(jù)。

甲氨蝶呤是公認(rèn)的治療RA首選的緩解病情藥物，根據(jù)2009年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)治療RA的推薦意見，一旦診斷明確，應(yīng)盡早應(yīng)用甲氨蝶呤，或以此藥為基礎(chǔ)進(jìn)行聯(lián)合治療〔7〕。此類藥物僅能控制RA的癥狀，且有胃腸道反應(yīng)、肝功損害、骨髓抑制等不良反應(yīng)，更佳的療效在于尋求于中西醫(yī)結(jié)合治療。復(fù)元膠囊由黃芪、生曬參、淫羊藿、枸杞子、川芎、丹參、三七等藥組成，具有益氣活血、滋肝補(bǔ)腎的功效，肝腎充足則骨有生機(jī)，體現(xiàn)標(biāo)本兼顧的治療原則。而MTX具有明確的抗炎、抑制免疫反應(yīng)等作用，能有效緩解RA病情，降低致殘率，故選其作為陽性對照。

在RA研究領(lǐng)域中，TNF-a、IL-1β及IL-6在RA發(fā)病機(jī)制中居于重要地位。TNF-α和IL-1β是RA發(fā)病機(jī)制中居中心地位的炎癥性細(xì)胞因子，參與RA的發(fā)生、發(fā)展過程。TNF-α可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，促進(jìn)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附滲透導(dǎo)致局部炎癥;可刺激滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2和膠原酶等，促進(jìn)骨質(zhì)破壞和骨的吸收及成纖維細(xì)胞增生，抑制骨膠原的合成，同時(shí)可增加滑膜及內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞生長因子的釋放而促進(jìn)血管翳的形成〔8〕。IL-1β比TNF-α有更強(qiáng)的刺激基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)產(chǎn)生及抑制膠原和糖蛋白合成，從而加重骨損傷的作用〔9〕。IL-1β還可刺激滑膜成纖維細(xì)胞增殖，增加膠原酶和溶質(zhì)素分泌，促進(jìn)滑膜細(xì)胞黏附分子(ICAM-1)的表達(dá)，使滑膜細(xì)胞與浸潤性炎性細(xì)胞反應(yīng)性增強(qiáng)〔10〕。在RA中，IL-6不能直接刺激滑膜母細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生作用，而是通過增強(qiáng)TNF-α和IL-1β的效應(yīng)，并且誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)揮致病作用。另外，IL-6還能促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白IgG、IgM 及合成類風(fēng)濕因子(RF)〔8〕。

前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)復(fù)元膠囊具有抑制血小板聚集和血栓形成、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)、調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血液流變學(xué)的異常等功能〔11，12〕。本實(shí)表明復(fù)元膠囊聯(lián)用甲氨蝶呤能顯著降低氣虛血瘀證RA大鼠血清炎性介質(zhì)，其作用機(jī)制可能與其具有抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防骨質(zhì)破壞等多重作用有關(guān)。本研究證實(shí)了對氣虛血瘀證RA的治療，在抗風(fēng)濕藥物治療同時(shí)配伍補(bǔ)益肝腎、益氣活血的中成藥，能顯著減輕炎癥過程中的腫脹，改善毛細(xì)血管的通透性，降低血清炎性介質(zhì)水平，藥物不良反應(yīng)無明顯增加，值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

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