杜冬華，周 靜，王愛華

（河北北方學院動物科技學院動物醫(yī)學系，河北 張家口075131）

雞減蛋綜合征（EDS－76）是由雞減蛋綜合征病毒引起的，臨床癥狀主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋雞產(chǎn)薄殼蛋或無殼蛋，產(chǎn)蛋率嚴重下降，是世界范圍內(nèi)危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一。

現(xiàn)已證實，EDSV基因組由線性雙鏈DNA組成，DNA的分子量為33kb，主要編碼五鄰體、pⅧ、六鄰體、pⅥ、纖維蛋白、DNA結合蛋白、DNA多聚合酶、100k、末端蛋白、lvaⅡ等結構蛋白。其中，六鄰體蛋白是EDSV的主要結構蛋白，多肽長910個氨基酸，約110kD，它與五鄰體蛋白和纖維蛋白一起構成腺病毒的衣殼，并決定病毒粒子的大小，其中含有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的抗原決定簇，對研制基因工程疫苗具有重要的意義［1－4］。

但目前對EDSV 六鄰體基因的研究局限于對其基因序列的分析，然后推導出氨基酸序列，對六鄰體蛋白的表達及功能的研究較少。因此，現(xiàn)在對減蛋綜合征病毒詳細的分子生物學背景仍不清楚，阻礙了后續(xù)研究進展。本試驗旨在對雞減蛋綜合征病毒河北分離株進行研究，利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，表達出六鄰體蛋白，探索其用于免疫預防的可行性，對研制基因工程疫苗有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料 雞抗 EDSV 國際標準株（AV－127）血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；兔抗EDSV－HB株血清由河北北方學院預防獸醫(yī)實驗室制備。

重組質(zhì)粒：包含六鄰體（Hexon）基因序列的重組質(zhì)粒pBS－H由本課題組構建。

1．2 Hexon基因原核表達載體構建 將含Hexon基因重組質(zhì)粒pBS－H 和原核表達載體pET－32a－c（＋）用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，純化后將二者連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名為pET－H。

1．3 目的基因的誘導表達 將重組質(zhì)粒pET－H轉(zhuǎn)化BL21（DE3），接入含 AMP（200μg／mL）的LB培養(yǎng)基。37℃振蕩培養(yǎng)至OD600＝0．6。從中取1 mL作為對照。剩余樣品加入IPTG至終濃度1 mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)3h。搖瓶冰浴5min，5 000r／min（4℃）離心5min收集菌體，棄上清，加入100 μL 1×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸10min 12 000 r／min（4℃）離心5min，取上清液10μL，參考文獻［5］方法，用7．5%的SDS－PAGE、Western－blotting檢測表達產(chǎn)物。

1．4 重組蛋白的大量表達 挑取重組菌單菌落接種于10mL氨芐青霉素／LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，接入2 000mL Amp／LB液體培養(yǎng)基，按上述方法誘導表達。參考文獻［9］方法，測定蛋白溶解性，純化表達蛋白。

1．5 重組蛋白動物免疫試驗 取6只6周齡雞，初次免疫將重組蛋白與福氏完全佐劑按1∶1的比例混合乳化，胸肌多點注射，100μg／只。2免和3免，將重組蛋白與不完全福氏佐劑按1∶1比例混合、乳化，加強免疫兩次，150μg／只，每次免疫間隔10d。3免后15d采集血樣并分離血清，用間接ELISA方法檢測免疫雞抗體水平。

2 試驗結果

2．1 重組質(zhì)粒pET－H雙酶切鑒定 重組質(zhì)粒pET－H用EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切鑒定，結果出現(xiàn)兩個條帶，其大小分別為2．7kb及5．9kb。表明Hexon基因已正確連接到pET－32a－c（＋）表達載體（見圖1）。

2．2 目的蛋白的表達 重組表達載體轉(zhuǎn)化BL21表達菌株經(jīng)誘導后，用SDS－PAGE方法分析，出現(xiàn)一條約110kDa的條帶，與預期結果相符，而未經(jīng)誘導菌株及空載體pET－32a的對照菌則未出現(xiàn)這一條帶，如圖2所示。

2．3 Western－blotting鑒定重組蛋白 將目的蛋白和空載體表達產(chǎn)物裂解后進行SDS－PAGE，再轉(zhuǎn)移到醋酸纖維膜上，兔抗EDSV－HB株血清作為一抗與之特異性結合，再經(jīng)HRP標記的羊抗兔IgG顯色，出現(xiàn)一條特異性抗原抗體結合帶，而空載體沒有，從而證明表達的目的蛋白是Hexon蛋白，結果如圖3。

2．4 免疫雞抗重組蛋白血清效價的檢測 將純化后的六鄰體蛋白以最佳包被濃度（1∶200，15μg／mL）包被96孔酶標反應板，按文獻［9］方法測定免疫雞的抗體效價，設陰性對照組，結果見表3。

陰性血清 OD490平均值為0．082，標準差為0．014，陰陽性臨界值為＝0．082＋ 3×0．014＝0．124，即陽性受檢血清抗體效價為OD490值高于0．124的最高血清稀釋倍數(shù)。

由表3可以看出，在免疫雞中，產(chǎn)生抗六鄰體蛋白的抗體效價最高達1∶12 800，且多數(shù)免疫雞抗體效價均在1∶6 400以上。表明體外表達的重組六鄰體蛋白能夠保留天然蛋白所具有的免疫原性。

表3 六鄰體蛋白免疫雞后ELISA抗體效價

3 討論

3．1 本試驗用pET－32a－c（＋）原核表達載體對雞減蛋綜合征病毒河北分離株六鄰體蛋白進行了優(yōu)化表達。表達的重組蛋白分子量約110kDa，經(jīng)SDSPAGE電泳分析，分子量與預期一致。之后，用Western－blotting方法檢測重組蛋白，用兔抗EDSV河北分離株陽性血清作為一抗與之進行特異性結合，再經(jīng)HRP標記的羊抗兔IgG二抗顯色，出現(xiàn)一條特異性的抗原抗體結合帶，而空載體則沒有，從而證明表達的目的蛋白是六鄰體蛋白，同時也可表明該重組蛋白具有免疫原性。

3．2 本試驗旨在探索用重組的六鄰體蛋白預防雞減蛋綜合征的可行性，純化的重組六鄰體蛋白免疫6周齡試驗雞后，3免后用間接ELISA方法檢測血清抗體水平。結果表明，本試驗得到的重組六鄰體蛋白能夠刺激機體產(chǎn)生高水平抗體，充分證明重組的六鄰體蛋白具有很好的免疫原性，為研制減蛋綜合征基因工程疫苗打下良好的基礎，但其生產(chǎn)成本、免疫劑量及免疫佐劑等方面的問題都有待進一步的解決。

［1］ 肖妙，工君偉．減蛋綜合癥病毒五鄰體重組蛋自的原核表達及抗原性鑒定［J］．東北農(nóng)業(yè)大學學報，2009，40（2）：83－87．

［2］ 吳國平．雞減蛋綜合征病毒分子生物學研究近況［J］．中國預防獸醫(yī)學報，2002，22（2）：156－158．

［3］ 張春杰，張敏，吳庭才，等．EDSV六鄰體蛋白基因克隆與原核表達載體構建［J］．河南科技大學學報，2005，4（26）：80－82．

［4］ 羅君毅，蓋偉偉，雷磊，等．SARS－CoV S蛋白的原核表達及其黏膜免疫效應［J］．武漢大學學報，2006，6（52）：733－738．

［5］ J．薩姆布魯克，D．W．拉塞爾著，黃培堂，等譯．分子克隆實驗指南［M］．第三版．北京：科學出版社，2002：96－98．