王豪舉，王 博，丁紅雷，2

（1．西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 北陪400715；2．重慶生產(chǎn)力促進(jìn)中心，重慶 渝北401147）

豬支原體肺炎是由豬肺炎支原體（Mhp）引起的一種慢性、接觸性傳染病，是豬場(chǎng)最常見(jiàn)的疫病之一。該病通常不引起豬只的死亡，但會(huì)使其出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等癥狀，造成食欲減退、生長(zhǎng)阻滯，飼料轉(zhuǎn)化率降低。該病通常與豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病、偽狂犬病等病毒性疾病和副豬嗜血桿菌病、巴氏桿菌病、鏈球菌病等細(xì)菌性疾病相互影響，形成豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征（Porcine respiration Disease Complex，PRDC），造成養(yǎng)豬業(yè)的重大損失。

面對(duì)該病造成的嚴(yán)重危害，疫苗的使用成為防控該病的首選，而疫苗研制的核心是尋找和鑒定保護(hù)性抗原。反向疫苗學(xué)［1］研究策略的建立，使得人們能夠從病原微生物的全基因組序列出發(fā)，全面系統(tǒng)地預(yù)測(cè)、分析和驗(yàn)證這些病原微生物的全部可能的候選疫苗蛋白抗原。目前已經(jīng)有4個(gè)Mhp菌株的全基因組測(cè)序工作完成，包括3個(gè)強(qiáng)毒株和1個(gè)無(wú)毒株，這為我們應(yīng)用反向疫苗學(xué)方法分析和預(yù)測(cè)Mph疫苗候選抗原創(chuàng)造了條件。本文著重論述了采用生物信息學(xué)方法，以Mhp強(qiáng)毒株232菌株作為出發(fā)菌株，結(jié)合其他菌株的基因組信息，從全基因組水平篩選候選抗原，為后續(xù)的研究提供候選抗原靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1．1 材料 Mhp232、Mhp168、Mhp7 448、Mhp J菌株全基因組序列及其他相關(guān)基因序列從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）獲得。

在線預(yù)測(cè)軟件SignalP 3．0［2］、DAS［3］、PSOR－Tb［4］、CELLO［5］、SOSUI－GramN［6］等通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)獲得。

1．2 在線預(yù)測(cè) 外膜蛋白和分泌蛋白是首選的疫苗候選蛋白抗原。我們采用逐級(jí)縮小范圍和平行預(yù)測(cè)相結(jié)合的方法預(yù)測(cè)該類蛋白。

以能引起豬支原體肺炎典型臨床癥狀的Mhp強(qiáng)毒株232株作為基礎(chǔ)，根據(jù)其全基因組對(duì)應(yīng)的相應(yīng)氨基酸序列，用SignalP 3．0軟件預(yù)測(cè)并篩選含有信號(hào)肽的蛋白；同時(shí)，用DAS軟件預(yù)測(cè)有跨膜區(qū)蛋白。將同時(shí)有信號(hào)肽和跨膜區(qū)的蛋白作為下一步預(yù)測(cè)的候選蛋白。

用PSORTb 3．0．2、CELLO version 2．5、SOSUI－GramN進(jìn)一步預(yù)測(cè)上述蛋白的亞細(xì)胞定位，這3個(gè)軟件均能預(yù)測(cè)革蘭陰性細(xì)菌和支原體的胞質(zhì)蛋白、內(nèi)膜蛋白、周質(zhì)蛋白、外膜蛋白和分泌蛋白。

根據(jù)上述結(jié)果，選取同時(shí)含有信號(hào)肽和跨膜區(qū)并被3個(gè)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位的軟件有兩個(gè)預(yù)測(cè)為外膜蛋白或分泌蛋白的蛋白作為下一步預(yù)測(cè)的候選蛋白。

將上一步預(yù)測(cè)的蛋白與 Mhp 168、7 448、J菌株的基因組對(duì)應(yīng)的蛋白的氨基酸序列比對(duì)，選取同時(shí)存在于此4個(gè)已測(cè)序菌株中且保守型較高的蛋白作為下一步預(yù)測(cè)的候選蛋白。

將上一步預(yù)測(cè)的蛋白與豬的基因組中所對(duì)應(yīng)的蛋白的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，去除和豬的基因組對(duì)應(yīng)蛋白同源性超過(guò)10%的蛋白。剩余的蛋白作為本次預(yù)測(cè)的疫苗候選蛋白抗原。

2 結(jié)果

2．1 Mhp 232菌株可能的膜蛋白或分泌蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果 Mhp 232菌株基因組全長(zhǎng)892 758bp，共編碼691個(gè)蛋白基因。為了增加信號(hào)肽分析的可靠性，對(duì)每一個(gè)候選蛋白同時(shí)采用SignalP 3．0的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型（Neural Network Model，NN）和隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）進(jìn)行分析，為了避免漏掉可能的候選蛋白，我們把兩個(gè)模型中其中有一個(gè)預(yù)測(cè)出可能存在信號(hào)肽的蛋白即將其判定為有信號(hào)肽。對(duì)Mhp232菌株691個(gè)候選蛋白的分析表明，有412個(gè)蛋白含有信號(hào)肽序列。通過(guò)用DAS軟件分析預(yù)測(cè)，共有407個(gè)蛋白存在跨膜區(qū)。我們將同時(shí)存在信號(hào)肽和跨膜區(qū)的301個(gè)蛋白判定為下一步預(yù)測(cè)的候選蛋白。

2．2 Mhp 232菌株可能的外膜蛋白和／或分泌蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果 在預(yù)測(cè)的Mhp232菌株301個(gè)可能的膜蛋白和分泌蛋白中，用PSORTb 3．0．2軟件預(yù)測(cè)，36個(gè)為外膜蛋白、1個(gè)為分泌蛋白，32個(gè)為可位于多個(gè)亞細(xì)胞位置的蛋白。用CELLO version 2．5軟件預(yù)測(cè)，85個(gè)為外膜蛋白，4個(gè)為分泌蛋白，38個(gè)為可位于多個(gè)亞細(xì)胞位置的蛋白；用SOSUIGramN軟件預(yù)測(cè)，48個(gè)為外膜蛋白，21個(gè)為分泌蛋白。將其中兩個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)為外膜蛋白和／或分泌蛋白的67個(gè)候選蛋白判定為232菌株中初步預(yù)測(cè)的候選蛋白抗原。

2．3 Mhp疫苗候選蛋白抗原的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果 將232菌株中的候選蛋白抗原進(jìn)一步與168、7 448、J菌株中相對(duì)應(yīng)的氨基酸與核苷酸序列比對(duì)，mhp444在J菌株為假基因，mhp017和mhp535基因在7 448菌株中存在同源序列，mhp532和mhp534基因在168菌株中存在同源序列，其余蛋白在其他三個(gè)已進(jìn)行全基因組測(cè)序菌株中均存在同源序列?；?Mhp017、Mhp444、Mhp532、Mhp534和Mhp535蛋白在Mhp菌株中保守性較差，將這5個(gè)蛋白在候選蛋白中去掉。其余基因的核苷酸序列同源性在86%～100%，其中只有3個(gè)低于95%，氨基酸序列同源性在88%～100%，也只有3個(gè)低于95%。

將這些蛋白與豬基因組中的所有基因?qū)?yīng)的蛋白進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析，這些蛋白均與Gen－Bank中已存在的豬的蛋白無(wú)同源性。將最終預(yù)測(cè)的62個(gè)蛋白均作為Mhp疫苗候選抗原（見(jiàn)表1）。

表1 豬肺炎支原體候選疫苗蛋白抗原

3 討論

目前對(duì)豬支原體肺炎尚無(wú)很好的治療辦法，臨床上常用抗生素來(lái)控制病情的進(jìn)一步發(fā)展。但隨著耐藥菌株越來(lái)越多，該病面臨無(wú)藥可用的境地。提高管理水平同時(shí)聯(lián)合使用疫苗能夠在一定程度上控制該病的蔓延，且已有多個(gè)滅活和減毒豬支原體肺炎疫苗在臨床上使用。但目前市售疫苗仍然存在兩個(gè)重要缺陷：一是免疫保護(hù)效果較差。接種該疫苗后，只有不超過(guò)50%的免疫豬能夠得到有效保護(hù)，這一保護(hù)比例和人們的期望值相比還有比較大的差距。二是接種疫苗后，豬只仍然能夠帶菌，并在豬群內(nèi)和豬群之間傳播。

從整體防控來(lái)看，使用疫苗預(yù)防是降低該病發(fā)生，減少經(jīng)濟(jì)損失最有前途和最經(jīng)濟(jì)的途徑。因此，制備有效的既能預(yù)防豬只感染又能顯著降低豬群中病原蔓延的疫苗就成為防控Mhp的核心。重新設(shè)計(jì)并制備具有高免疫保護(hù)力的疫苗對(duì)于預(yù)防該病的發(fā)生和病原的傳播有重要意義。采用反向疫苗學(xué)策略，從全基因水平來(lái)篩選具有高保護(hù)性候選抗原是現(xiàn)代疫苗學(xué)發(fā)展的方向。一、能夠大量獲取有重要免疫學(xué)效應(yīng)又在病原體內(nèi)表達(dá)較少，不能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原。二、能夠評(píng)價(jià)傳統(tǒng)疫苗中缺失的與致病密切相關(guān)的分泌蛋白，避免了疫苗設(shè)計(jì)中關(guān)鍵蛋白的缺失。三、某些在病原體的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用的蛋白，在病原體非天然生存狀態(tài)下，如體外培養(yǎng)中，其表達(dá)可能關(guān)閉。這是滅活疫苗制備中的重大缺陷。利用反向疫苗學(xué)則可以高效表達(dá)和篩選這些蛋白。

合適的保護(hù)性抗原首先應(yīng)該是位于菌體表面或者是分泌性的。這樣的抗原最易與機(jī)體的免疫系統(tǒng)接近，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。支原體的細(xì)胞膜由內(nèi)膜、外膜脂質(zhì)雙層組成，內(nèi)外膜之間構(gòu)成周質(zhì)空間。一些蛋白位于膜上，發(fā)揮傳遞細(xì)胞信號(hào)、能量物質(zhì)代謝等功能。外膜蛋白和分泌蛋白是病原菌刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答最主要的蛋白。這也是為什么要選擇外膜蛋白和分泌蛋白作為候選蛋白抗原的原因。其次，保護(hù)性抗原應(yīng)該是保守的。病原體的復(fù)制、代謝以及致病是長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)化的結(jié)果，導(dǎo)致宿主致病也是其獲得物質(zhì)代謝的原料、維持生命活動(dòng)必不可少的過(guò)程。因此，這些維持生命活動(dòng)的關(guān)鍵蛋白應(yīng)該是保守的。所以，選擇保守性強(qiáng)的蛋白也是在篩選疫苗候選蛋白抗原的一個(gè)重要原則。從本次在全基因組水平預(yù)測(cè)的結(jié)果來(lái)看，Mhp的所有62個(gè)候選蛋白抗原存在于所有已測(cè)序的Mhp菌株。因此，這些蛋白是保守性很高的候選抗原。

Mhp183（P97）、Mhp378、Mhp677（P65）是目前最常用的 Mhp疫苗候選抗原［7－8］，它的部分功能也已經(jīng)被闡明。但其作為候選抗原制備的疫苗與傳統(tǒng)Mhp疫苗相比免疫效果并無(wú)明顯改善，可能這些蛋白不是Mhp致病的最主要的致病因素，或者只是在Mhp導(dǎo)致的宿主細(xì)胞病理?yè)p傷中的一個(gè)小小環(huán)節(jié)，這些環(huán)節(jié)缺失在一定程度上是可以被代償?shù)?，或者還需要其他蛋白協(xié)同才能發(fā)揮作用。在Mhp與宿主細(xì)胞相互作用的過(guò)程中，其他蛋白也發(fā)揮著重要作用，如 Mhp182、Mhp280、Mhp494。在本研究所預(yù)測(cè)篩選的62個(gè)候選蛋白抗原中，有44個(gè)是未知功能的推定蛋白，占71%，他們非常保守，又處于和宿主細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)和信號(hào)交換的外膜或胞外，他們?cè)贛hp與外界的物質(zhì)、能量和信號(hào)交換中可能發(fā)揮不可替代的或極其重要的作用，是疫苗制備中重要的蛋白抗原。

另外，基于這些推定蛋白的關(guān)鍵位置和保守性，也為研究Mhp的致病過(guò)程、致病機(jī)理和免疫反應(yīng)機(jī)制提供了良好的目標(biāo)分子。他們的功能需要大量的基礎(chǔ)研究去闡明，研究他們?cè)贛hp的致病中扮演什么樣的角色。因此，本研究也為基礎(chǔ)研究提供了大量的候選蛋白。

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