張俊珍，范瑞文，白俊明，董常生

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷030801）

皮膚包括表皮、真皮和皮下組織，是機(jī)體的保護(hù)性器官。皮膚內(nèi)組織決定毛纖維生長(zhǎng)、毛色形成、皮膚性質(zhì)等功能。羊駝毛纖維柔軟纖細(xì)且具有多種顏色，是紡織原料的“軟黃金”，其遺傳資源豐富［1］，是對(duì)毛纖維進(jìn)行生物學(xué)特性研究的資源庫(kù)或活標(biāo)本。羊駝皮膚韌性強(qiáng)，也是優(yōu)質(zhì)的皮革原料。這些特點(diǎn)都是由皮膚中表達(dá)的基因決定的，本課題組已構(gòu)建了羊駝皮膚的cDNA文庫(kù)，并進(jìn)行了大規(guī)模測(cè)序（以庫(kù)名為 ASCD提交到 NCBI）［2］，為研究羊駝皮膚基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)?；虻谋磉_(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，而其結(jié)合位點(diǎn)決定著轉(zhuǎn)錄的效率。

真核生物轉(zhuǎn)錄起始十分復(fù)雜，往往需要多種蛋白因子的協(xié)助，轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶Ⅱ形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄因子的 結(jié) 合 位 點(diǎn) （transcription factor binding site，TFBS）是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)時(shí)，與轉(zhuǎn)錄因子mRNA結(jié)合的區(qū)域，TFBS長(zhǎng)度一般為6～12bp范圍內(nèi)，位于基因非編碼區(qū)，大部分位于5′側(cè)翼區(qū)，但有時(shí)也位于3′側(cè)翼區(qū)或內(nèi)含子區(qū)。轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)特異性結(jié)合調(diào)控區(qū)域的DNA序列來(lái)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程。一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子往往同時(shí)調(diào)控若干個(gè)基因，而它在不同基因上的結(jié)合位點(diǎn)具有一定的保守性，又不完全相同［3］。本文通過(guò)對(duì)獲得的表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，EST）進(jìn)行分析，以發(fā)現(xiàn)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并用實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)表達(dá)豐度高的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行不同毛色皮膚中的相對(duì)定量檢測(cè)，為研究調(diào)控羊駝皮膚發(fā)育和毛色生物學(xué)的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 本文所用材料為本室構(gòu)建的白色青年羊駝皮膚cDNA文庫(kù)，該文庫(kù)經(jīng)大規(guī)模測(cè)序，并提交到 NCBI的EST序列（庫(kù)名為 ASCD）（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／nucest？term＝alpaca ＆dong）。

1．2 方法

1．2．1 序列信息處理 用CAP3軟件（華大基因公司）將EST序列進(jìn)行裝配，再用BLASTN軟件將裝配好的序列與NCBI nr數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，并用GO軟件（華大基因公司）對(duì)發(fā)現(xiàn)的已知序列進(jìn)行注釋和聚類(lèi)。

1．2．2 對(duì)皮膚基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行比較基因組分析 應(yīng)用oPOSSUM分析軟件（http：／／www．cisreg．ca／cgibin／oPOSSUM／opossum），參照人皮膚中表達(dá)的同類(lèi)已知基因，分析羊駝皮膚可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn) 。脊椎動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的Fisher score＜0．1時(shí)認(rèn)為是有效的。

1．2．3 高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點(diǎn)在不同毛色羊駝皮膚中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析 取液氮保存的羊駝皮膚組織用 Trizol Reagent提取總 RNA，并用Nanodrop測(cè)定其濃度。分別取1μg總RNA用SYBR Prime ScriptTMRTPCR KIT（Perfect Real Time）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：10μL反應(yīng)體系中含5×Prime ScriptTM Buffer 2μL，Prime ScriptTMRTEnzyme Mix10．5μL，Oligo dT Primer25pmol，隨機(jī)引物50 pmol，Total RNA 1μL，DEPC水加至10μL。上述成分混勻后置于PCR儀器中，反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃5s。RT產(chǎn)物保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

取RT產(chǎn)物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：20 μL反應(yīng)體系中含SYBR Premix ExTaqTM1×，上下游引物各0．2μmol／L（MITF F：5′－AAGTTGCAACGAGAACAGCA－3′，R：5′－CAGTTCTCAAGAGCGGGTTC－3′；CREB1F：5′－GTGTTACGTGGGGGAGAGAA－3′，R：5′－GGGCTAATGTGGCAATCTGT－3′），引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成），ROX Reference DyeⅡ（50×）1×，cDNA模板2μL（約500ng），ddH2O加至20 μL。設(shè)置95℃預(yù)變性30s后，95℃5s，55℃30s，72℃10s，43個(gè)循環(huán)。溫度反應(yīng)結(jié)束，由熔點(diǎn)曲線判定PCR反應(yīng)的特異性，根據(jù)熒光曲線的CT值計(jì)算定量結(jié)果。內(nèi)參基因18SrRNA（引物 F：5′－GAAGGGCACCACCAGGAGT－3′，R：5′－GAGACAAATCACTCCACCAA－3′）與目的基因在同一條件下不同管內(nèi)擴(kuò)增，每個(gè)樣本設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果

2．1 羊駝皮膚中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子 為了找出調(diào)節(jié)皮膚基因表達(dá)的可能的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，本文選擇530個(gè)基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在羊駝皮膚中有8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，而且大部分為低豐度表達(dá)。但MITF的表達(dá)量稍高于其他7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（表1）。

表1 羊駝皮膚中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子

2．2 羊駝皮膚中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn) 針對(duì)羊駝皮膚中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，應(yīng)用oPOSSUM分析軟件發(fā)現(xiàn)6個(gè)不同類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。其中，CREB1屬于BZIP類(lèi)型，與靶基因結(jié)合的預(yù)測(cè)分值最高（表2）。

表2 羊駝皮膚中轉(zhuǎn)錄因子可能的結(jié)合位點(diǎn)

2．3 MITF與CREB1在不同毛色羊駝皮膚中的表達(dá)分析 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，MITF在棕黑色羊駝皮膚中的表達(dá)量顯著高于其在白色羊駝皮膚中的表達(dá)量，呈5．938倍數(shù)關(guān)系；同時(shí)，CREB1在棕黑色羊駝皮膚中的表達(dá)量顯著高于其在白色羊駝皮膚中的表達(dá)量，呈2．997倍數(shù)關(guān)系（見(jiàn)圖1）。

圖1 MITF和CREB1基因在不同毛色羊駝皮膚中的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

3 討論和結(jié)論

根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)可分為兩類(lèi)：第一類(lèi)為普遍轉(zhuǎn)錄因子它們與RNA聚合酶Ⅱ共同組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄才能在正確的位置開(kāi)始。第二類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factor，TF）為組織細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，這類(lèi)TF是在特異的組織細(xì)胞或是受到一些類(lèi)固醇激素、生長(zhǎng)因子或其他刺激后，開(kāi)始表達(dá)某些特異蛋白質(zhì)分子時(shí)需要的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。從表1可以看出，羊駝皮膚中存在與皮膚發(fā)育和毛色調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，關(guān)于這些因子有過(guò)相關(guān)的報(bào)道。如熱激基因轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcription factor family member 5）是調(diào)控?zé)峒せ蚧钚缘男盘?hào)傳導(dǎo)鏈中的最終成員［4］。而熱激蛋白是機(jī)體處在熱脅迫和大量化學(xué)脅迫的環(huán)境中時(shí)產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，而致體內(nèi)相關(guān)基因的活性迅速增加，并以分子伴侶的形式幫助相關(guān)蛋白折疊、穩(wěn)定、組裝、胞內(nèi)運(yùn)輸和降解，使機(jī)體免受環(huán)境脅迫的影響，在熱境中存活［5］。

Verdoni發(fā)現(xiàn)將角化細(xì)胞中的SRF失活可對(duì)鼠表皮的發(fā)育起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用［6］。雖然眾所周知Pax 5可防止淋巴癌，但它在免疫系統(tǒng)外所起的作用也有了相關(guān)報(bào)道，與其相關(guān)的含有成對(duì)box的轉(zhuǎn)錄因子Pax 3在黑色素細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用［7］。在羊駝皮膚中，尤其是發(fā)現(xiàn)了組織細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子MITF，MITF是黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素生成相關(guān)酶基因的特異的轉(zhuǎn)錄因子［8－9］，屬bHLH－LZ（basic helix－loop－h(huán)elix－leucine－zipper）的成員［10］，通過(guò)識(shí)別靶基因啟動(dòng)子區(qū)的E－box（CAYRTG）、M－box（TCAYRTG or CAYRTGA）［11］和T－box［12］的序列而使靶基因轉(zhuǎn)錄。黑色素細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)毛色形成的轉(zhuǎn)錄因子MITF的結(jié)合位點(diǎn)之一，即CREB－1，CREB－1的靶基因預(yù)測(cè)分值最高，該位點(diǎn)在羊駝黑色素細(xì)胞中是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)［［Mypaper］13］。而 且，相對(duì)定量PCR 結(jié)果顯示，MITF和CREB1在不同毛色羊駝皮膚中的表達(dá)量存在顯著差異?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)CREB通過(guò)結(jié)合cAMP反應(yīng)元件在黑色素細(xì)胞中刺激轉(zhuǎn)錄，從而在cAMP信號(hào)路徑中起調(diào)節(jié)作用［14］。在羊駝黑色素細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)了 MITF的靶基因 Melanocortin receptor－1（MC1R）、endothelin receptor B （EDNRB）、tyrosinase（TYR）、TYR－related protein 1 （TYRP1）和TYR－related protein 2（DCT）等毛色基因（圖2），這對(duì)掌握羊駝皮膚中決定毛色以及其他生理功能的分子機(jī)理提供重要的基礎(chǔ)，為后續(xù)研究其他哺乳動(dòng)物皮膚生物學(xué)以及色素形成的調(diào)控提供了資源。

圖2 MITF轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)和靶基因間的關(guān)系

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