陳雪鋒，李恩擴(kuò)，王肖祎，陳 靜，胡敬東

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安271018）

細(xì)胞因子作為一種具有多活性多功能的小分子蛋白，在機(jī)體中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，而其產(chǎn)生的過多和不足則對(duì)于病理生理學(xué)很有意義［1］。

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（Reticuloendotheliosis，RE）是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科中的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）引起的一種可以侵害多種禽類的嚴(yán)重免疫抑制性疾病［2］，迄今對(duì)REV感染在分子水平上對(duì)細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)作用的影響等尚缺乏深入研究。為進(jìn)一步了解該病的發(fā)生和免疫機(jī)制，我們對(duì)1日齡SPF雛雞人工感染REV 后主要免疫器官中IL－6和IFN－γ兩種重要細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試劑和儀器 SYBR Green熒光定量PCR試劑盒、DNA Marker DL－2 000等，購自寶生物工程（大連）有限公司；熒光定量PCR儀7500型，購自美國ABI公司；八聯(lián)管，購自美國Axygen公司；TransZol Up和反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1．1．2 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡SPF雞，購自山東濟(jì)南SAIS家禽科技有限公司［許可證號(hào)：SCXK（魯）20090003）］。

1．1．3 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV），由崔治中教授惠贈(zèng)。

1．1．4 引物合成 根據(jù)GenBank上登錄的雞白細(xì)胞介素6（ChIL－6）基因、雞γ干擾素（ChIFN－γ）基因和內(nèi)參核糖體蛋白亞基4（RPL4）基因序列，應(yīng)用DNAStar軟件設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，經(jīng)BLAST分析后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成。引物序列見表1。

表1 3種基因引物序列

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物試驗(yàn) 120只1日齡SPF雞隨機(jī)分為2組：REV處理組和正常對(duì)照組（處理組每只腹腔注射102TCID50REV，對(duì)照組注射等量生理鹽水），每組60只，飼養(yǎng)方式相同，每組分別于7、14、21、28、35、42、49d隨機(jī)取6只剖殺（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)取6只雞），立即取脾臟、胸腺和腔上囊并置于－80℃，備用。

1．2．2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 雞的3種免疫器官總RNA提取按照TransZol Up說明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄按照 TransScript First－Strand cDNA Synthesis SuperMix說明書進(jìn)行，cDNA放－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系及程序以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板分別擴(kuò)增目的基因IL－6、IFN－γ和內(nèi)參基因RPL4。依次在PCR管中加入以下試劑：10×PCR Buffer 2μL，dNTP 4μL，MgCl2（25mmol／L）2μL，上下游引物各1μL，cDNA 2μL，ddH2O 7．8 μL，TaqDNA polymerase 0．2μL，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃5min；94℃45s，56℃45s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

1．2．4 IL－6和IFN－γSYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立 反應(yīng)總體積為20μL，其中SYBR Premix ExTaqTM（200×）10．0μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0．4μL，上、下游引物（10 μmol／L）各0．4μL，質(zhì)粒模板2．0μL，滅菌蒸餾水6．8μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性15s；95℃變性5s，60℃退火34s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。為了分析SYBR Green I PCR 擴(kuò)增特異性，應(yīng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物制作熔解曲線，條件為：95℃15s，60℃1min，95℃15 s，60℃15s。反應(yīng)設(shè)內(nèi)參RPL4基因和空白對(duì)照（去離子水代替引物及模板）。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)獲得的信號(hào)、數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并利用配機(jī)軟件進(jìn)行分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。

1．2．5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測不同時(shí)期IL－6和IFN－γmRNA的轉(zhuǎn)錄水平 以純化的cDNA為模板，內(nèi)參RPL4為對(duì)照，每一時(shí)期取6個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)3次，用建立的最優(yōu)方法進(jìn)行檢測。

1．2．6 數(shù)據(jù)處理與分析 根據(jù)比較閾值法［3］計(jì)算出目的基因的相對(duì)含量，目的基因的相對(duì)含量＝2－△△Ct。注釋：△△Ct＝［CtT－CtHK］X－［CtTCtHK］0，T＝待測基因；HK＝內(nèi)參基因；X＝待測樣本；0＝校正樣本。數(shù)據(jù)采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組試驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 IL－6、IFN－γ和內(nèi)參 RPL4基因片段的 PCR擴(kuò)增 IL－6、IFN－γ和RPL4基因片段的PCR產(chǎn)物4μL，于4%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果分別出現(xiàn)1條254bp、259bp和154bp左右的DNA帶（圖1），與預(yù)期大小一致。

圖1 IL－6、IFN－γ和RPL4基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

2．2 IL－6、IFN－γ和 RPL4基因片段重組質(zhì)粒的鑒定 對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果三段都與GenBank上已發(fā)表的序列完全一致。

2．3 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線的建立

熔解曲線（圖2）分析表明，該方法擴(kuò)增的目的基因（IL－6和IFN－γ）和內(nèi)參基因（RPL4）均具有特異性，只出現(xiàn)各自的單一峰，無引物二聚體或其他非特異性產(chǎn)物生成。

2．4 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 該方法具有較高的靈敏度，IL－6和IFN－γ的檢測下限均為100copies／μL，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率分別為－3．08（IL－6）、－3．16（IFN－γ）和－3．15（RPL4），3種基因的擴(kuò)增效率均107%左右，其相關(guān)系數(shù)也均在0．99以上，符合比較閾值法相對(duì)定量分析的前提，檢測所得Ct值可按比較閾值法分析。

圖2 IL－6、IFN－γ和RPL4的實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線

2．5 IL－6和IFN－γ基因熒光定量的表達(dá)水平 本試驗(yàn)將對(duì)照組7d時(shí)兩種細(xì)胞因子基因的表達(dá)量作為參照因子，處理組及其他時(shí)期兩種細(xì)胞因子基因的表達(dá)量與其相比，得到相應(yīng)基因表達(dá)量的倍數(shù)，采用內(nèi)參RPL4對(duì)兩種細(xì)胞因子基因進(jìn)行均一化處理，SPF雞免疫器官兩種細(xì)胞因子基因的相對(duì)表達(dá)情況見圖3。

從圖3～5中可以反映出，處理組與對(duì)照組相比，3種免疫器官的IL－6和IFN－γ基因表達(dá)量在同一時(shí)間點(diǎn)各自升幅雖有所不同，但總體均差異顯著（P＜0．05）或極顯著（P＜0．01）。

3 討論

本試驗(yàn)用人工感染的方法復(fù)制禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)REV感染SPF雞胸腺、脾臟和腔上囊的IL－6、IFN－γ表達(dá)量進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，試驗(yàn)組IL－6、IFN－γmRNA 轉(zhuǎn)錄水平均明顯升高（P＜0．05），我們認(rèn)為這種過度表達(dá)會(huì)損害免疫器官。Y．S．Zheng等［4］在 REV 感染SPF雞后IFN－γ分泌的高峰期時(shí)檢測到了腔上囊和胸腺的顯著萎縮，也支持了我們的上述觀點(diǎn)。同時(shí)國外已有學(xué)者報(bào)道，REV感染還會(huì)引起脾細(xì)胞腫瘤壞死因子（TNF）水平明顯增高，這種過高水平的TNF對(duì)免疫器官有免疫損傷作用，與免疫功能的下降密切相關(guān)［5］。

圖5 腔上囊IL－6和IFN－γ基因在不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量

Kaiser等［6］研究發(fā)現(xiàn)，馬立克病毒早期溶細(xì)胞感染期，易感雞脾細(xì)胞中ChIL－6mRNA含量顯著升高，ChIL－6的高水平轉(zhuǎn)錄又指示了病變的加劇，促進(jìn)了淋巴瘤的發(fā)生，而抗性雞中ChIL－6含量無變化，利于疾病的轉(zhuǎn)歸。同樣，馬立克病毒感染后雞體內(nèi)ChIFN－γ含量升高，升高程度取決于宿主的遺傳背景及病毒毒力［6－7］。而我們?cè)赗EV感染模型中觀察到的現(xiàn)象顯然與前述結(jié)果相似，因此有理由相信IL－6、IFN－γ作為兩種重要的前炎性細(xì)胞因子在REV致病過程中發(fā)揮的作用很可能類似于它們?cè)诹硪恢铝鲂择R立克病毒感染中的作用，或者說兩者有相似的變化規(guī)律。

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