王世佳,林浩鵬,李升康

(1.汕頭大學(xué)廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 汕頭 515063;2.汕頭大學(xué)生物系,廣東 汕頭 515063)

0 引言

擬穴青蟹(S.paramamosain),屬于十足目(Decapoda),梭子蟹科(Portunidae),青蟹屬(Syclla de Hann),廣泛分布于我國東南沿海,包括浙江、福建、臺灣、廣東、廣西和海南沿海水域[1].擬穴青蟹屬于暖水,廣鹽性蟹類,肉質(zhì)鮮美,營養(yǎng)豐富,個體大,生長快,適應(yīng)性強(qiáng),具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,在我國傳統(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖中占有重要地位,也是汕頭牛田洋圍墾區(qū)養(yǎng)殖的主要品種之一.近年來,汕頭沿海青蟹養(yǎng)殖基地屢遭病害,導(dǎo)致了青蟹產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)效益的嚴(yán)重?fù)p失[2].研究青蟹免疫相關(guān)基因,探索青蟹的先天性免疫機(jī)制,從而更好的為青蟹病害的免疫防治服務(wù)就顯得十分必要.在擬穴青蟹中,誘導(dǎo)型NOS基因(inducible NOS,iNOS)能被一些細(xì)胞因子或免疫刺激物誘導(dǎo),被認(rèn)為是一種典型的免疫相關(guān)基因.通過一氧化氮合成酶合成的NO,主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫調(diào)控[3],在青蟹的先天性免疫防御中起非常重要的作用.本研究旨在通過分析擬穴青蟹NOS蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu),并在三級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)的同源建模,為進(jìn)一步研究SpNOS空間結(jié)構(gòu)和免疫功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 NOSs基因與生物信息學(xué)分析軟件

擬穴青蟹NOS蛋白的基因序列來自NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),其登錄號為FR875156.1.其他物種NOS蛋白登錄號為:南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)(ADD63793.1),囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)(BAI67609.1),斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)(ACJ54486.1),眼斑龍蝦(Panulirus argus)(ACZ60615.1),濱蟹(Carcinus maenas)(ACY56317.1),黑背陸棲蟹(Gecarcinus lateralis)(AAT46681.1);三級結(jié)構(gòu)可視化軟件Cn3D,RasWin及AntheProt 3D Viewer;序列分析軟件DNAStar;分析結(jié)果顯示軟件Antheprot Graphic Viewer.建模軟件EASR-Modeller,評估網(wǎng)站為http://nihserver.mbi.ucla.edu.

1.2 SpNOS一級結(jié)構(gòu)分析

利用Expert Protein Analysis System(ExPASy)的蛋白分析工具對SpNOS蛋白的氨基酸組成、相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析.用ScanProsite分析蛋白的功能域.采用ProtScale工具(http:∥www.expasy.ch/tools/protscale.html)中的Kyte and Doolittle算法對SpNOS蛋白進(jìn)行疏水性分析,通過Expasy的2ZIP數(shù)據(jù)庫預(yù)測亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)[4].利用HMMTOP在線服務(wù)器http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html分析SpNOS蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)[5].

1.3 SpNOS二級結(jié)構(gòu)分析

利用CFSSP在線服務(wù)器(http://www.biogem.org/tool/chou-fasman/)[6],Sopma(http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)[7]在線服務(wù)器,Psipred在線服務(wù)器(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)等對SpNOS蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,包括α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲及延伸鏈等[8].

1.4 SpNOS三級結(jié)構(gòu)分析

利用Swiss-Prot在線分子模建服務(wù)器及Phyre2服務(wù)器對SpNOS蛋白序列進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)分析.通過BLAST分析得到模板鏈,利用(Procheck)將對照模板構(gòu)建的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行評估.利用EASY-Modeller建模并進(jìn)行能量的優(yōu)化,優(yōu)化后利用Procheck對模建結(jié)果進(jìn)行檢測,計(jì)算得出Ramachandran圖[9].

圖1 SpNOS蛋白各種氨基酸組成比例圖

2 結(jié)果

2.1 SpNOS氨基酸組成特性分析

分析結(jié)果(表1)表明,擬穴青蟹NOS蛋白由1214個氨基酸組成,原子總數(shù)為

19 137個,分子式為C6100H9469N1711O1807S50,分子量為137 290.6 Da,理論等電點(diǎn)為6.56.SpNOS蛋白中各種氨基酸的比例見圖1.在所有組成氨基酸中,亮氨酸含量

最高為9.1%,色氨酸含量最低為1.6%. 擬穴青蟹NOS蛋白氨基酸組成與其他物種比較結(jié)果表明,擬穴青蟹SpNOS蛋白與眼斑龍蝦(Panulirus argus)NOS蛋白氨基酸組成最為相似.

2.2 SpNOS結(jié)構(gòu)域分析

將SpNOS蛋白的氨基酸序列提交到ScanProsite服務(wù)器,對SpNOS蛋白進(jìn)行翻譯后修飾位點(diǎn)結(jié)構(gòu)分析.結(jié)果顯示,該蛋白中有1個黃素氧還原蛋白類似物域,一個鐵氧還蛋白型黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合域,19個酪氨酸激酶II磷酸化位點(diǎn),5個酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn),11個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn),16個豆蔻?；稽c(diǎn),2個酰胺化位點(diǎn),2個N-糖基化位點(diǎn),1個cAMP和cGMP依賴型蛋白激酶磷酸化位點(diǎn),并在其序列中發(fā)現(xiàn)一段雙向核定位域(422-437)和一段30AA長的脯氨酸富集域(1171-1201).

利用HMMTOP在線服務(wù)器http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html分析SpNOS的跨膜結(jié)構(gòu).結(jié)果表明,其為胞外蛋白,沒有跨膜結(jié)構(gòu).

采用ProtScale工具(http://www.expasy.ch/tools/protscale.html)中的Kyte和Doolittle算法對SpNOS蛋白進(jìn)行疏水性分析.結(jié)果表明,該蛋白中含有較多親水性氨基酸,親水性較強(qiáng).

將SpNOS蛋白序列提交至Expasy的2ZIP數(shù)據(jù)庫預(yù)測亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu).結(jié)果顯示,SpNOS不含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu).

2.3 SpNOS二級結(jié)構(gòu)分析

通過CFSSP服務(wù)器(http://www.biogem.org/tool/chou-fasman/)預(yù)測SpNOS的二級結(jié)構(gòu)成分.結(jié)果表明,SpNOS中可能形成α-螺旋的氨基酸殘基有790個,占氨基酸總數(shù)的65.1%;可能形成延伸鏈的殘基有764個,占氨基酸總數(shù)的62.9%;可能形成不規(guī)則卷曲的氨基酸殘基有152個,占氨基酸總數(shù)的12.5%.

通過SOPMA服務(wù)器(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預(yù)測SpNOS的二級結(jié)構(gòu)成分.結(jié)果表明,α-螺旋和不規(guī)則卷曲交替存在,是SpNOS整體結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)元件.蛋白的兩段都由α-螺旋占據(jù),一端有一段不規(guī)則卷曲聚集區(qū),僅有少量α-螺旋存在.延伸鏈均勻分布在整條鏈中.這種分布有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定.

2.4 SpNOS蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析及同源建模

由于SpNOS的氨基酸數(shù)目達(dá)到1000以上,整條鏈建模并不十分可靠.因此,通過對三段進(jìn)行分割分別建模,三段分別為1-422個氨基酸(模型一),423-919個氨基酸(模型二),920-1214個氨基酸(模型三).三段蛋白采用的模板分別為2G60(小鼠抗FLAG抗原結(jié)合片段),3HR4(人類一氧化氮合成酶及鈣調(diào)蛋白復(fù)合體),1QGY(念珠藻鐵氧還蛋白),得到三個結(jié)構(gòu),到PROCHECK中檢查,得到了可靠的結(jié)果(圖2ABC).其拉氏圖的可靠性分別達(dá)到98.3%,98.2%和96.8%(圖2BCD).

3 討論

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是NO合成過程中的關(guān)鍵酶.目前,已經(jīng)確定的NOS有神經(jīng)元型(neuronal NOS,nNOS)、內(nèi)皮型(endothelial NOS,eNOS)和誘導(dǎo)型(inducible NOS,iNOS)三種,它們作用于精氨酸生成NO而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng).NO除具有神經(jīng)傳導(dǎo)和松弛平滑肌等功能外,還具有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲等作用[10],它可以通過作用于病原體的核酸、蛋白質(zhì)和脂類等殺滅病原體[11].

已經(jīng)證實(shí),SpNOS是一種誘導(dǎo)性的NOS(iNOS)[3].誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶iNOS能被一些細(xì)胞因子或免疫刺激物誘導(dǎo).近幾年iNOS作為抗病力指標(biāo)在哺乳動物、魚類、以及昆蟲和貝類等無脊椎動物中已有比較深入的研究[4].研究發(fā)現(xiàn),白斑綜合癥病毒(WSSV)在感染中國明對蝦初期可以誘導(dǎo)血細(xì)胞產(chǎn)生iNOS,隨著WSSV在中國明對蝦體內(nèi)的大量增殖及其對血細(xì)胞的破壞,使得iNOS活性顯著降低,對蝦也趨于死亡.由此,iNOS能夠作為反映對蝦在病毒感染過程中健康狀況的有效指標(biāo),在水產(chǎn)免疫方面具有重大意義[12].

圖2 三維結(jié)構(gòu)模型及拉氏圖分析

同源建模已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種生物體的基因功能預(yù)測[13-16].本研究以SpNOS為對象,首先在理化性質(zhì)方面與眼斑龍蝦,南美白對蝦,濱蟹,囊對蝦,斑節(jié)對蝦,黑背陸棲蟹等六種甲殼類動物的NOS蛋白做了比較,發(fā)現(xiàn)在氨基酸殘基總數(shù),原子總數(shù),堿性氨基酸總數(shù),酸性氨基酸總數(shù),理論等電點(diǎn)方面,擬穴青蟹NOS蛋白與眼斑龍蝦NOS蛋白更為接近.

跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果顯示NOS蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu).疏水性分析的結(jié)果顯示擬穴青蟹NOS蛋白中含有較多的親水性蛋白,親水性較強(qiáng),也與NOS是非跨膜蛋白的結(jié)果相符.亮氨酸拉鏈預(yù)測結(jié)果表明擬穴青蟹NOS蛋白序列中沒有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu),可以推測NOS蛋白不是DNA結(jié)合蛋白.在功能域分析中,發(fā)現(xiàn)SpNOS的N-端有一段長達(dá)30個氨基酸(1171-1201)的脯氨酸富集域,推測該區(qū)域可能與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合,引發(fā)級聯(lián)反應(yīng),作用于免疫通路.

二級結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有著很大影響.本研究所采用的chou-fasman方法是比較經(jīng)典的預(yù)測方法.SOPMA服務(wù)器和Pispred服務(wù)器是目前應(yīng)用較廣也較為成熟的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)器,兩者都是通過對氨基酸評分來預(yù)測可能的二級結(jié)構(gòu)的.SOPMA服務(wù)器相比chou-fasman方法,篩選更加嚴(yán)格,避免了一個氨基酸形成多種二級結(jié)構(gòu)的可能.Pispred服務(wù)器的評分系統(tǒng)比SOPMA服務(wù)器更為嚴(yán)格,結(jié)果展示也更為直觀.三種方法的預(yù)測結(jié)果都顯示NOS蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋和不規(guī)則卷曲,散在的延伸鏈散布在整條鏈中.

本實(shí)驗(yàn)通過同源建模的方法,得到SpNOS三部分的模型,其拉氏圖結(jié)果表明結(jié)構(gòu)比較合理.但是,整個SpNOS分子的三維結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步研究.由于SpNOS長達(dá)1214個氨基酸,PDB數(shù)據(jù)庫中還無法找到對應(yīng)整條鏈的模板蛋白.于是,我們通過對其三個不同的保守域進(jìn)行分別建模,得到三個模型.PROCHECK檢測發(fā)現(xiàn),模型質(zhì)量不太好.因此,本次研究利用了EASY-Modeller進(jìn)行建模.通過Blast搜索PDB中同源性最高的蛋白,以同源性最高的蛋白質(zhì)為模板建模,建立其模型后,通過軟件附屬功能可以對其實(shí)現(xiàn)能量最小化(共軛梯度法)和動力學(xué)模擬,進(jìn)行簡單的人為修改,而且所得模型的能量能通過表格自動展現(xiàn)出來,本實(shí)驗(yàn)得出來的結(jié)果通過PROCHECK分析,符合質(zhì)量要求.

甲殼類動物不存在特異性免疫,研究具體的免疫相關(guān)基因可以豐富我們對其先天性免疫系統(tǒng)的認(rèn)識.擬穴青蟹的NOS蛋白空間結(jié)構(gòu)的模擬研究對于探究擬穴青蟹NOS在其非特異性免疫系統(tǒng)中的作用意義重大.本研究利用生物信息學(xué)的方法對擬穴青蟹的NOS蛋白進(jìn)行了一級、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和同源建模分析.但由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)和作用途徑及其復(fù)雜,預(yù)測結(jié)果需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證才能得出確切的結(jié)論.

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