邢曉會，趙 翔，李希妍，成艷輝，譚敏菊，郭俊峰，黃維娟，隗合江，曾曉旭，王大燕，舒躍龍

近年來，全球每年都有B型流感病毒流行，并在部分地區(qū)引起小規(guī)模暴發(fā)，且有研究表明B型流感也能導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)［1－2］。B型流感病毒有兩種表面糖蛋白：血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）。HA的功能是識別并結(jié)合靶細(xì)胞表面的唾液酸受體，NA的功能是催化裂解唾液酸使子代病毒釋放并防止病毒形成聚集體，在這兩種蛋白貌似相反的功能機(jī)制下病毒得以入侵細(xì)胞并隨后釋放子代病毒，HA和NA在功能上相互影響，并會發(fā)生協(xié)同突變，以利于病毒的復(fù)制和傳播［3］。

NA抑制劑是目前上市的唯一對B型流感病毒有效的一類藥物，包括奧斯他韋，扎那米韋等，而B型流感病毒NA基因的變異會導(dǎo)致毒株對該類藥物的敏感性下降。隨著各國耐藥性監(jiān)測體系的建立和完善，到目前為止，全球已經(jīng)積累了相當(dāng)?shù)哪退幭嚓P(guān)突變株信息，因此有必要探究B型流感病毒耐藥相關(guān)突變株的特點(diǎn)和規(guī)律，以獲得科學(xué)依據(jù)，提高流感防控能力。

1 材料與方法

1．1 毒株 中國國家流感中心采用血凝抑制實(shí)驗(yàn)對?。屑壖部刂行淖?008年1月至2012年12月寄送的B型流感病毒進(jìn)行復(fù)核鑒定，若為陽性，則選取部分毒株進(jìn)行序列測定。血凝抑制實(shí)驗(yàn)方法參見參考文獻(xiàn)［4］。

1．2 病毒RNA提取 使用德國QIAGEN公司Rneasy?Mini Kit，在QIACUBE全自動工作站提取病毒 RNA，100μL Rnase Free Water溶解后于－70℃保存?zhèn)溆?。操作按試劑盒和儀器使用手冊進(jìn)行。

1．3 一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR） 采用德國 QIAGEN 公司的one－step RT－PCR Kit，按使用手冊進(jìn)行操作。反應(yīng)體系共25μL：Rnase Free Water 16μL，5×buffer 5μL，10mmol／L dNTP 1 μL，RNAsin 0．13μL，Enzymix 1μL，上下游引物各0．5μL，RNA模板1μL。反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄60℃l min，42℃20min，50℃20min，95℃15min，PCR擴(kuò)增94℃30s，55℃30s，72℃1min，循環(huán)35次后，72℃10min。使用美國Affymetrix公司的USB?HT ExoSAP－IT?High－Throughput PCR Product Cleanup對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后，用于下一步測序反應(yīng)。

1．4 測序 使用美國ABI公司的BigDye?Terminator v3．1Kit。反應(yīng)體系共 10μL：Rnase Free Water 5．5μL，5×Sequencing Buffer 1．5μL，引物1μL，RR－2500 1μL，PCR純化產(chǎn)物1μL。測序反應(yīng)條件為先96℃1min，然后循環(huán)擴(kuò)增：96℃10 s，50℃5s，60℃4min，循環(huán)25次。使用ABI公司的BigDye?XTerminatorTM Purification Kit即SAMTMSolution對測序反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化，然后在ABI公司的3730xl全自動DNA測序儀讀取序列。

1．5 序列分析和進(jìn)化樹分析 利用Lasergene 7．1中的SeqMan軟件對DNA測序儀測得的序列進(jìn)行拼接。此外，從 NCBI的Influenza Virus Database下載所需B型流感病毒的HA和NA基因序列。將我國2008－2012年測得的B型流感病毒序列、全球其他國家的B型耐藥相關(guān)突變株、近期疫苗株以及國內(nèi)國際同期流行株的NA核苷酸序列和對應(yīng)的HA核苷酸序列分別利用MEGA5．0軟件進(jìn)行序列比對和分析，找出所有NA耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)，并通過與同期敏感株相比，找出伴隨這些NA耐藥相關(guān)突變的其它NA突變和HA突變。進(jìn)一步利用MEGA5．0軟件，采用鄰位相鄰法（Neighbor－Joining）分別構(gòu)建HA和NA基因進(jìn)化樹，設(shè)置bootstrap值為2000。

1．6 突變位點(diǎn)在蛋白質(zhì)分子模型中的標(biāo)記 在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）中下載已有的B／Perth／211／2001病毒的NA蛋白晶體結(jié)構(gòu)模型（PDB ID：3K36）和 B／Brisbane／60／2008病毒的HA蛋白晶體結(jié)構(gòu)模型（PDB ID：4FQM），在此基礎(chǔ)上獲得B型流感病毒的NA單體和HA單體晶體結(jié)構(gòu)模型，利用RasWin軟件展示和標(biāo)記耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)和伴隨突變位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2．1 NA耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)與伴隨突變位點(diǎn) 通過序列分析，在我國2008－2012年682株B型流感病毒中，共發(fā)現(xiàn)6株B型流感病毒的NA基因攜帶耐藥相關(guān)突變。全球其他地區(qū)發(fā)現(xiàn)的B型耐藥相關(guān)突變株共有22株，其中有4株病毒的NA突變僅為文獻(xiàn)報(bào)道，但在NCBI中未收錄其NA基因序列，本文未做分析。故本文共分析了24株病毒的NA序列和其相應(yīng)的HA序列，NA耐藥相關(guān)突變以及伴隨的NA其它突變和HA突變位點(diǎn)信息總結(jié)于表1。由表1可知，我國2008年沒有發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)突變株；2009年發(fā)現(xiàn)1株，攜帶H273Y突變；2010年發(fā)現(xiàn)3株，均攜帶I221T突變；2011年發(fā)現(xiàn)2株，分別攜帶I221T突變和D197N突變；2012年我國所有B型流感病毒的NA均未發(fā)生與耐藥相關(guān)的位點(diǎn)突變。上述6株病毒中除攜帶H273Y突變的毒株屬于B－Victoria系之外，其他5株病毒均屬于B－Yamagata系。

表1 B型流感病毒NA耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)以及NA、HA伴隨突變位點(diǎn)Tab．1 Mutations associated with drug resistance in NA and the secondary mutations in NA or HA gene of influenza B virus

全球其他地區(qū)的耐藥相關(guān)突變株最早發(fā)現(xiàn)于1987年，而2010－2011年發(fā)現(xiàn)的耐藥相關(guān)突變株最多，2012年沒有發(fā)現(xiàn)。這些突變株大多攜帶I221V／T、D197N、H273Y和E117G／A等常見位點(diǎn)突變，也有少量毒株攜帶 A245T／S、T325I和R374K等罕見位點(diǎn)突變。上述24株耐藥相關(guān)突變株中有13株屬于B－Victoria系、11株屬于BYamagata系。

在我國重慶和上海發(fā)現(xiàn)的、攜帶NA I221T突變的4株B－Yamagata毒株，只有1株（即B／Shanghai－Pudongxi／1125／201）攜 帶 HA S208P 伴 隨 突變，其他3株不攜帶任何NA或HA伴隨突變；而在美國北卡羅來納州聚集性病例中發(fā)現(xiàn)的、攜帶NA I221V突變的3株B－Victoria病毒株均伴隨NA T8M、NA S397R和 HA V15I突變，其中有1株（即B／North Carolina／13／2010）還伴隨 NA K360E 突變，或許正是由于這些伴隨突變的存在才使得這些攜帶NA I221V突變的B型病毒當(dāng)時(shí)能夠在社區(qū)中引起暴發(fā)流行。

攜帶NA D197N突變的B－Yamagata系毒株B／Beijing－Xicheng／11496／2011攜帶 NA T437I伴隨突變；同樣發(fā)生NA D197N突變的B／Rochester／02／2001病毒則攜帶 NA K418N 和 HA D／E164G伴隨突變。發(fā)生NA H273Y突變的B－Victoria系毒株B／HunanLousong／1826／2009不攜帶任何 NA或HA伴隨突變，美國H273Y突變株B／Michigan／20／2005也為B－Victoria系，則攜帶2個 HA伴隨突 變 S10A、V190I，而 加 拿 大 B－Yamagata 系H273Y 突變株 B／Ontario／006876／2011攜帶4個NA伴隨突變T46P、L153M、E288G、L455M。

總體而言，我國2008－2012年發(fā)現(xiàn)的6株耐藥相關(guān)突變株攜帶的伴隨突變位點(diǎn)較少（僅有2個），而國外發(fā)現(xiàn)的耐藥相關(guān)突變株攜帶的伴隨突變較多，并且我國的耐藥相關(guān)突變株攜帶的耐藥相關(guān)突變大多相同，但伴隨突變均不相同，提示這些伴隨突變是隨機(jī)發(fā)生的，也可能與地域差異有關(guān)。

2．2 NA和HA基因序列進(jìn)化分析 為分析耐藥相關(guān)突變株NA和HA基因的進(jìn)化特征，利用MEGA5．0軟件對全球（包括我國）所有B型耐藥相關(guān)突變株、近期疫苗株以及國內(nèi)外同期未發(fā)生耐藥相關(guān)突變的流行株序列構(gòu)建進(jìn)化樹，共計(jì)包括101株病毒的NA核苷酸序列和相應(yīng)的HA核苷酸序列，結(jié)果如圖1和圖2所示，可見我國的耐藥相關(guān)突變株大多屬于B－Yamagata系，國外的大多屬于BVictoria系?？傮w而言，我國耐藥相關(guān)突變株的NA、HA序列與國外的NA、HA序列處于不同的進(jìn)化分支。

圖1 B型流感病毒的NA耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)及其NA、HA伴隨突變位點(diǎn)Fig．1 Mutations associated with drug resistance in NA and the secondary mutations in NA or HA of influenza B virusThe mutations associated with drug resistance in NA were showed in purple font and the secondary mutations in NA or HA in black font．Mutations associated with drug resistance were showed in the same color with the corresponding secondary mutations．A：The crystal structure of NA；B：The crystal structure of HA．

2．3 耐藥相關(guān)突變株的NA和HA蛋白晶體結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 利用RasWin軟件分別展示耐藥相關(guān)突變株NA和HA蛋白的表面和內(nèi)部位點(diǎn)。圖3為利用RasWin軟件標(biāo)記的B型流感病毒NA耐藥相關(guān)突變以及NA、HA伴隨突變，由該圖可以看出，有些突變位點(diǎn)位于NA酶活性中心或HA受體結(jié)合部位，也有些位于NA、HA的結(jié)構(gòu)框架位點(diǎn)（framework）上，還有個別突變位于NA、HA的非功能區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)。在整個空間構(gòu)型上，有些耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)與其伴隨突變位點(diǎn)相距較遠(yuǎn)，有些則相距較近。

圖2 B型流感病毒耐藥相關(guān)突變株NA基因進(jìn)化分析Fig．2 Phylogenetic analysis of NA gene of influenza B viruses associated with drug resistanceBlack circle－－Strains associated with drug resistance isolated from China；Black triangle－－Strains associated with drug resistance isolated from other countries in the world；Black square－－Recent vaccine candidate strains．

3 討 論

B型流感病毒的兩種表面糖蛋白HA和NA，是影響流感病毒在體內(nèi)生存的重要因素，并且其功能相互影響。Fumihiro［5］等的研究表明，發(fā)生 HA E190K突變的A（H1N1）病毒在表達(dá)NA的MDCK細(xì)胞（即NA－MDCK）中的生長情況優(yōu)于其在不表達(dá)NA的MDCK細(xì)胞（即正常MDCK細(xì)胞）中的生長情況，體現(xiàn)了HA和NA在功能上的協(xié)同補(bǔ)償機(jī)制。

圖3 B型流感病毒耐藥相關(guān)突變株HA基因進(jìn)化分析Fig．3 Phylogenetic analysis of HA gene of influenza B viruses associated with drug resistanceBlack circle－Strains associated with drug resistance isolated from China；Black triangle－Strains associated with drug resistance isolated from other countries in the world；Black square－Recent vaccine candidate strains．

NA耐藥相關(guān)突變均位于NA的酶活性功能區(qū)或結(jié)構(gòu)區(qū)，這些突變的產(chǎn)生，會導(dǎo)致NA的功能受到影響，可能會降低病毒的復(fù)制和傳播能力。NA耐藥相關(guān)突變對病毒適應(yīng)性和傳播力造成的影響可依下述因素不同而不同［6］：突變位置（催化位點(diǎn)或者結(jié)構(gòu)位點(diǎn)），NA型別／亞型，毒株的遺傳背景，NA補(bǔ)償突變的存在，NA功能的損失程度，以及適當(dāng)?shù)腍A－NA功能平衡。另外，宿主免疫反應(yīng)的不同以及遺傳背景的差異也會對其產(chǎn)生影響。既往有研究表明，攜帶NA R150K耐藥相關(guān)突變的B型流感病毒在雪貂中的感染性和傳播性有所降低［7］，而與此相反，攜帶NA D197N突變的B型流感病毒在雪貂中的生長特性與野生型相似［8］，這些差異，可能是伴隨突變的影響造成的。伴隨突變對NA耐藥相關(guān)突變株的毒株特性的影響，在A型流感病毒的相關(guān)研究較多，Jesse［9］等和 Teridah［10］等分別指出，A 型流感病毒NA發(fā)生的部分突變（如：R194G，R222Q，V234M等）以及HA發(fā)生的部分突變（如：T82K，K141E，R189K等）可對耐藥相關(guān)NA突變起到一定的補(bǔ)償作用，因此我們推測B型流感病毒也存在耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)之外的起補(bǔ)償作用的位點(diǎn)，因此，我們對全球B型流感病毒耐藥相關(guān)突變株的序列特點(diǎn)進(jìn)行了分析，并發(fā)現(xiàn)了多個位于NA和HA基因的伴隨突變位點(diǎn)。本文發(fā)現(xiàn)的伴隨突變位點(diǎn)為進(jìn)一步通過反向遺傳學(xué)的方法驗(yàn)證這些位點(diǎn)對B型流感病毒的適應(yīng)性和傳播力的補(bǔ)償功能打下了基礎(chǔ)。

2011年初，美國從北卡羅來納州的聚集性病例中，分離到14株對奧司他韋和帕拉米韋敏感性降低的B型流感病毒［11］。這提示我們，出現(xiàn)生物學(xué)適應(yīng)性未降低的流感病毒耐藥株是很有可能的，況且目前發(fā)現(xiàn)的耐藥相關(guān)突變株其突變位點(diǎn)多種多樣，因此應(yīng)進(jìn)一步在全球范圍內(nèi)加強(qiáng)對流感病毒的耐藥性監(jiān)測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)新的耐藥相關(guān)突變株，并做好流感大流行出現(xiàn)耐藥株的應(yīng)對措施。我們的研究表明，我國的B型流感病毒耐藥情況與國際情況并不十分一致，故應(yīng)更加密切監(jiān)測我國流感病毒的耐藥情況，這對于我國流感防控策略的制定和臨床用藥具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

［1］Paul Glezen W，Schmier JK，Kuehn CM，etal．The burden of influenza B：a structured literature review［J］．Am J Public Health，2013，103（3）：e43－51．DOI：10．2105／AJPH．2012．301137

［2］Feng L，Shay DK，Jiang Y，etal．Influenza－associated mortality in temperate and subtropical Chinese cities，2003－2008［J］．Bull World Health Organ，2012，90（4）：279－288．DOI：10．2471／BLT．11．096958

［3］Myers JL，Hensley SE．Oseltamivir－resistant influenza viruses get by with a little help from permissive mutations［J］．Expert Rev Anti Infect Ther，2011，9（4）：385－388．DOI：10．1586／eri．11．2

［4］Kendal AP，Pereia MS，Shekel J．Concepts and procedures for laboratory－based influenza surveillance［M］．Geneva： World Health Organization，1982．

［5］Gen F，Yamada S，Kato K，etal．Attenuation of an influenza A virus due to alteration of its hemagglutinin－neuraminidase functional balance in mice［J］．Arch Virol，2013，158（5）：1003－1011．DOI：10．1007／s00705－012－1577－3

［6］Govorkova EA．Consequences of resistance：in vitro fitness，in vivoinfectivity，and transmissibility of oseltamivir－resistant influenza A viruses［J］．Influenza Other Respi Viruses，2013，Suppl 1：50－57．DOI：10．1111／irv．12044

［7］Gubareva LV，Matrosovich MN，Brenner MK，etal．Evidence for zanamivir resistance in an immunocompromised child infected with influenza B virus［J］．J Infect Dis，1998，178（5）：1257－1262．

［8］Mishin VP，Hayden FG，Gubareva LV．Susceptibilities of antiviral－resistant influenza viruses to novel neuraminidase inhibitors［J］．Antimicrob Agents Chemother，2005，49（11）：4515－4520．

［9］Bloom JD，Gong LI，Baltimore D．Permissive secondary mutations enable the evolution of influenza oseltamivir resistance［J］．Science，2010，328（5983）：1272－1275．DOI：10．1126／science．1187816

［10］Ginting TE，Shinya K，Kyan Y，etal．Amino acid changes in hemagglutinin contribute to the replication of oseltamivir－resistant H1N1influenza viruses［J］．J Virol，2012，86（1）：121－127．DOI：10．1128／JVI．06085－11

［11］Sleeman K，Sheu TG，Moore Z，etal．Influenza B viruses with mutation in the neuraminidase active site，North Carolina，USA，2010－11［J］．Emerg Infect Dis，2011，17（11）：2043－2046．DOI：10．3201／eid1711．110787