賈引軍，熊小路，王錫樂，齊 永，焦 俊，段長松，龔文平，溫博海

普氏立克次體（Rickettsia prowazekii）是流行性斑疹傷寒的病原體，普氏立克次體引起的疾病稱為流行性斑疹傷寒（epidemic typhus）。流行性斑疹傷寒是一種急性傳染病，其臨床主要特征為起病急、持續(xù)高熱和瘀點樣皮疹，常伴有劇烈頭痛、背痛，嚴重病人多有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀。流行性斑疹傷寒的傳播媒介為體虱，故該病又稱虱傳斑疹傷寒（louse－borne typhus）。在戰(zhàn)爭、災荒或其它衛(wèi)生情況差的情況下，虱極易繁衍和在集團人群中移動，特別容易引起流行性斑疹傷寒的暴發(fā)，故該病在戰(zhàn)爭時發(fā)生稱為戰(zhàn)爭熱（war fever）。第一次世界大戰(zhàn)，普氏立克次體感染2～3千萬人，引起數(shù)百萬人死亡。近數(shù)十年來，隨著大規(guī)模戰(zhàn)爭的消失、人民生活和衛(wèi)生條件的改善，未出現(xiàn)流行性斑疹傷寒的大規(guī)模流行。但是，局部戰(zhàn)爭和災荒仍使得流行性斑疹傷寒在某些國家流行，只要人群中有虱的寄生，流行性斑疹傷寒發(fā)生的可能性就存在［1］。

快速確診可能出現(xiàn)的普氏立克次體感染是有效防控流行性斑疹傷寒的關(guān)鍵。目前，流行性斑疹傷寒的診斷主要依賴普氏立克次體全菌抗原做間接免疫熒光（IFA）血清學分析。普氏立克次體全菌抗原的制備步驟繁雜，并且需要高水平的生物安全設備；另外IFA的不同立克次體種屬菌體之間的血清學交叉反應也影響其診斷的可靠性［2－3］。因此，發(fā)現(xiàn)普氏立克次體特異性抗原代替全菌抗原做斑疹傷寒的血清學診斷很有必要［4］。依據(jù)已發(fā)表的普氏立克次體全基因序列和鑒定的普氏立克次體主要蛋白抗原［5－8］，結(jié)合生物信息學分析，我們選擇8個預測抗原性較強的普氏立克次體蛋白抗原分子作為候選診斷抗原。本研究采用分子克隆方法制備出這8個抗原的重組蛋白，并用免疫印跡分析這些重組蛋白，篩選與普氏立克次體感染血清特異反應的蛋白分子作為流行性斑疹傷寒血清學診斷的候選抗原。

1 材料與方法

1．1 立克次體菌株與實驗感染小鼠血清 普氏立克次體（E株）、莫氏立克次體（Wilmington株）、立氏立克次體（Sheila Smith株）、黑龍江立克次體（054株）、恙蟲病東方體（Gilliam株）、貝氏柯克斯體（新橋株）等立克次體菌株為軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所立克次體學專業(yè)實驗室保存。用Vero細胞感染的方法對黑龍江立克次體和立氏立克次體進行傳代和保種［9］，其余的立克次體用7日齡雞胚接種的方法進行傳代、保種［10］。用以上立克次體分別腹腔接種6周齡BALB／c小鼠，每只接種107菌；感染4周后活殺小鼠取血，分離血清－20℃凍存?zhèn)溆茫?－10］。將每種立克次體感染小鼠血清5份混合，將混合血清用相應的立克次體抗原片按常規(guī)方法做間接免疫熒光［11］，測得普氏立克次體感染小鼠血清效價為1∶640，莫氏立克次體為1∶640，立氏立克次體為1∶1 280，黑龍江立克次體為1∶1 280，恙蟲病東方體為1∶320，貝氏柯克斯體為2560。做免疫印跡時，每種血清按其間接免疫熒光抗體效價的1／10稀釋；5份正常小鼠血清混合后做1∶50稀釋。

1．2 試劑與材料 引物為生工生物工程（上海）有限公司合成；Ex Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶試劑為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒為德國QIAGEN產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物回收試劑盒為Bio Basic Inc產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒為OMEGA產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、DL－2000Marker、低分子量蛋白Marker等為中科瑞泰（北京）生物科技有限公司產(chǎn)品；HRP標記羊抗小鼠IgG為北京思語偉業(yè)公司產(chǎn)品；DAB顯色試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品。

1．3 普氏立克次體主要的蛋白抗原基因 結(jié)合文獻報告［12－14］的普氏立克次體主要蛋白抗原，從普氏立克次體E株的全基因組序列（序列號：NC＿000963）中找出相應基因，同時用DNA Star軟件中的Protean程序預測蛋白的抗原指數(shù)及指標［15］其中包括親水性、電荷分布等因素，從而篩選出抗原性較強的8個主要抗原基因（sca5、ftsZ、groEL、omp、rp828、tolC、tsf、tuf）。

1．4 目的基因的擴增 用Primer5．0軟件設計8個目的基因擴增引物，引物設計的基本原則為保留預測到的主要抗原區(qū)；其中sca5由于長度超過2 000bp，將其分成兩段（sca5－1和sca5－2）設計對引物進行PCR擴增；引物中加入與質(zhì)粒pET－32a相應的酶切和連接位點（表1）。目的基因產(chǎn)物擴增采用50μL反應體系，普氏立克次體DNA模板2 μL（40ng／μL），上下游引物各1μL（20μmol／L），Taq DNA 聚合酶1．25u，dNTP Mixture 2μL，PCR Buffer 5μL；擴增條件為95℃ 預變性5min，然后以95℃ 變性30s、55℃ 退火30s、72℃延伸1min循環(huán)35次，最后72℃延伸5min。將擴增產(chǎn)物做1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳完后將凝膠上的目的DNA帶切下，再用凝膠DNA回收試盒分離純化擴增的基因片段。

1．5 重組蛋白制備 將擴增好的目的基因和pET－32a質(zhì)粒分別用相應的內(nèi)切酶進行酶切。將回收的酶切目的基因與相應的質(zhì)粒按常規(guī)條件進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。依據(jù)常規(guī)方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞［16］。在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上接種轉(zhuǎn)化菌，用PCR及酶切鑒定帶有目的基因重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌。按常規(guī)方法用IPTG誘導生長在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化菌表達重組蛋白；誘導表達后加入樣本液裂解轉(zhuǎn)化菌，然后對裂解樣本做聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分析，鑒定轉(zhuǎn)化菌表達的目的蛋白。對表達目的蛋白的轉(zhuǎn)化菌在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中IPTG誘導生長，按Qiagen公司的Ni－NTA純化試劑盒說明書表達的重組蛋白進行分離純化。

表1 普氏立克次體主要抗原基因的PCR擴增引物Tab．1 Primer－pairs of genes encoding major antigens of R．prowazekii

1．6 對重組蛋白抗原進行免疫印跡分析 用純化后的重組蛋白10μL（0．8mg／mL）加入等量的2×SDS上樣緩沖液煮沸5min進行SDS－PAGE電泳，采用半干電轉(zhuǎn)印法將電泳分離后純化重組蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維（PVDF）膜上。感染血清使用前先和超聲裂解pET－32a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在室溫下中和2h，以去除血清中與大腸桿菌非特異性反應抗體。將血清用含5%脫脂奶粉的PBS緩沖液稀釋，稀釋比例為IFA檢測效價的1／10倍。將稀釋后血清與載有重組蛋白的PVDF膜室溫作用1h，用PBST（含有0．05%吐溫的PBS緩沖液）洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG（1∶2 000）室溫反應1h，然后經(jīng)過3次PBST洗滌后以DAB顯色試劑盒顯色。

2 結(jié) 果

2．1 重組目的蛋白的原核細胞表達 將9對PCR擴增引物分別作PCR，得到了相應的DNA片段與預期大小相符合。將目的基因片段插入原核表達質(zhì)粒構(gòu)建相應的重組菌。在IPTG的誘導下9個重組菌中均表達目的蛋白（圖1）。采用Ni－NTA對表達的重組蛋白進行親和純化，SDS－PAGE分析確認獲得分子量與設計大小一致的重組目的蛋白（圖2）。

圖1 SDS－PAGE分析重組菌表達目的蛋白Fig．1 Analysis of the expressed target proteins by SDS－PAGE

2．2 免疫印跡分析重組蛋白 將6種立克次體感染小鼠血清與9個重組蛋白抗原做免疫印跡，普氏立克次體感染血清除與TolC反應陰性外，與其它8個蛋白反應陽性；莫氏立克次體感染小鼠血清與Sca5－1、Sca5－2、Omp、EF－Tu等4個蛋白反應陽性；貝氏柯克斯體感染血清與Sca5－1、Sca5－2、EF－Tu等3個蛋白反應陽性；恙蟲病東方體感染血清與Sca5－1反應陽性；立氏立克次體感染血清反應與Sca5－1和EF－Tu反應陽性；黑龍江立克次體感染血清不與任何蛋白反應（表2、圖3）。

圖2 SDS－PAGE電泳分析純化重組蛋白Fig．2 Analysis of the purified recombinant proteins by SDSPAGE

3 討 論

依據(jù)已發(fā)表的普氏立克次體全基因序列和鑒定的普氏立克次體主要蛋白抗原，結(jié)合生物信息學分析，選擇 Sca5、FtsZ、Omp、GroEL、Rp828、TolC、EF－Ts、EF－Tu等8個預測抗原性較強的普氏立克次體蛋白抗原分子，作為流行性斑疹傷寒候選診斷抗原。根據(jù)普氏立克次體E株的全基因序列分析及其注釋發(fā)現(xiàn)：Sca5和Omp為普氏立克次體的表面蛋白；GroEL為60kD熱休克蛋白，為分子伴侶、對蛋白的折疊起作用［17］；TolC是膜表面的通道蛋白；EF－Ts和EF－Tu為DNA復制的延伸因子，在立克次體入侵中為GTP水解提供能量；FtsZ可能與立克次體的分裂調(diào)控有密切關(guān)系；Rp828推測可能是一種與宿主細胞表面相互作用的蛋白。這些蛋白均可呈現(xiàn)在菌體表面，為普氏立克次體的主要表面抗原。我們采用分子克隆技術(shù)研制出與其相應的9個重組蛋白（其中Sca5分子大，制備2個重組蛋白Sca5－1和Sca5－2）。用普氏立克次體等6種立克次體感染小鼠血清與這9個重組蛋白抗原做免疫印跡，分析重組蛋白抗原的血清學反應特異性。

圖3 立克次體感染小鼠血清免疫印跡分析普氏立克次體重組蛋白抗原Fig．3 Analysis of the recombinant protein antigens by immunoblot assay with sera from mice infected with rickettsiaeLane 1：Sca5－1；2：Sca5－2；3：FtsZ；4：GroEL；5：Omp；6：Rp828；7：TolC；8：EF－Ts；9：EF－Tu．A：Sera from mice infected with R．prowazekii；B：Sera from mice infected with R．mooseri；C：Sera from mice infected with R．rickettsii；D：Sera from mice infected with R．heilongjiangensis；E：Sera from mice infected with Orientia tsutsugamushi；F：Sera from mice infected with C．burnetii；G：Sera from normal mice．

表2 免疫印跡分析普氏立克次體重組蛋白抗原Tab．2 Immunoblotting of the recombinant protein antigens of R．prowazekii

結(jié)果顯示FtsZ、GroEL、EF－Ts、Rp828等4個蛋白特異性最好，僅與普氏立克次體感染小鼠血清反應，因此FtsZ、GroEL、EF－Ts、Rp828等4個蛋白抗原可以認作普氏立克次體特異性抗原。其次是Omp，它除與普氏立克次體感染小鼠血清反應外，僅與莫氏立克次體感染血清反應。莫氏立克次體與普氏立克次體有最密切的親緣關(guān)系，用全菌抗原對其感染動物或患者血清做IFA時，呈現(xiàn)嚴重的血清學交叉。如果采用這些普氏立克次體特異性蛋白抗原做血清學檢測（如ELISA或蛋白芯片分析）將有可能很好的區(qū)分普氏立克次體與莫氏立克次體感染。本研究僅僅是采用實驗感染動物血清對這些普氏立克次體重組蛋白抗原特異性進行了分析，仍需要采用相應感染患者血清對其做進一步分析，以明確其在斑疹傷寒血清學診斷中的應用價值。

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