陳經(jīng)雕，劉美真，柯碧霞，譚海玲，李柏生，柯昌文

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是一種能在豬群中正常攜帶，偶爾導(dǎo)致豬、人發(fā)病的人獸共患的動(dòng)物源性微生物。根據(jù)其莢膜多糖抗原的異同劃分為35個(gè)血清型，其中豬鏈球菌2型為優(yōu)勢(shì)致病血清型，而不同豬鏈球菌2型菌株間的致病力又存在明顯的差異，這種差異可能與各菌株所攜帶的毒力因子有很大關(guān)系［1］。目前認(rèn)為豬鏈球菌2型的毒力因子主要包括莢膜多糖（cps2J）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）、溶血素（sly）、谷氨酸脫氫酶（gdh）、胞外因子（ef）、纖連蛋白／血纖蛋白原結(jié)合蛋白（FBPS）和毒力相關(guān)序列ORF2等［2］。為了解廣東地區(qū)豬鏈球菌2型菌株毒力基因分布及分子分型情況，本研究選取了其中5個(gè)毒力基因?qū)ξ沂》蛛x自病人和病豬的豬鏈球菌2型菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)分析，并對(duì)菌株進(jìn)行MLST分子分型，為診斷、治療和制定豬鏈球菌疫情防控措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)菌株 2005－2008年共22株，其中17株來(lái)自病人（其中2005年5株分別來(lái)自潮州、陽(yáng)江、深圳、韶關(guān)和佛山，2006年5株分別來(lái)自江門(mén)、廣州、佛山、中山和惠州，2007年7株分別來(lái)自佛山、江門(mén)、深圳各2株和廣州1株），5株來(lái)自病豬（均為2008年分別來(lái)自肇慶2株、河源、茂名、惠州各1株），陽(yáng)性對(duì)照的豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)株SS2（來(lái)自德國(guó)）核酸由江蘇省疾控中心惠贈(zèng)。

1．2 試劑來(lái)源 診斷血清購(gòu)自丹麥（STATENS SERUM INSTITUT）公司，API 20Strep生化鑒定試驗(yàn)條購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司，分子生物學(xué)試劑購(gòu)自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司，引物由上海生工公司合成，均在有效期內(nèi)使用。測(cè)序反應(yīng)用PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（v3．1，ABI）試劑盒，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 菌株鑒定［3］從菌落形態(tài)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)及API 20Strep生化鑒定分別對(duì)菌株進(jìn)行種、型鑒定。1．3．2 毒力因子檢測(cè)［3］

1．3．2．1 菌株DNA提取 用煮沸法或細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取所有菌株的基因組DNA，試劑盒提取可參考說(shuō)明書(shū)操作。

1．3．2．2 引物 見(jiàn)表1。

表1 5個(gè)毒力基因的引物序列及產(chǎn)物大小Tab．1 Five virulence genes’primer sequences and product sizes

1．3．2．3 PCR反應(yīng)體系 反應(yīng)體系為25μL，10×PCR Premix緩沖液12．5μL，上、下游引物（10 mmol／L）各1μL，模板2μL，用去離子水調(diào)整終體積至25μL。反應(yīng)結(jié)束后各取5μL于1% 瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1．4．1 多位點(diǎn)序列分析（MLST）

1．4．1．1 提取細(xì)菌基因組DNA 按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，提取的基因組－20℃保存待用。

1．4．1．2 PCR 擴(kuò)增、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析 參照文獻(xiàn)［4－5］分 別 用 PCR 擴(kuò) 增 aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA和thrA7個(gè)管家基因DNA片段，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后測(cè)序。各管家基因序列經(jīng)DNA star SeqMan軟件處理后與數(shù)據(jù)庫(kù)http：／／ssuis．mlst．net／進(jìn)行比對(duì)，獲得各位點(diǎn)的等位基因數(shù)值，并形成相應(yīng)的菌株等位基因譜，提交MLST 網(wǎng)站，確定序列分型（Sequence Type，ST）。

2 結(jié) 果

2．1 菌株鑒定 對(duì)22株菌株進(jìn)行菌落形態(tài)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)及API 20Strep生化鑒定，全部菌株均為豬鏈球菌2型。

2．2 毒力基因檢測(cè) 22株菌分為5種毒力基因型，其中病人及病豬菌株均有cps2J＋／mrp＋／sly＋／gdh＋／ef＋型別（病人7株、病豬3株），cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh－／ef＋ （6 株）、cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh＋／ef＋（4株）為病人分離株所特有，cps2J＋／mrp－／sly＋／gdh＋／ef＋（1株）、cps2J＋／mrp－／sly－／gdh＋／ef－（1株）為病豬分離株所特有，圖1為部分菌株的cps2J基因片段結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

2．3 MLST分型 對(duì)所有菌株的7個(gè)管家基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序、比對(duì)分析顯示，均能夠在數(shù)據(jù)庫(kù)找到對(duì)應(yīng)的基因型，共有3個(gè)基因型，分別為ST1型（病人9株、病豬2株）、ST7型（病人8株、病豬2株）和ST28（病豬1株）型，其中ST1、ST7型菌株親緣關(guān)系極近，均同屬于ST1克隆復(fù)合物。結(jié)果見(jiàn)圖2。

表2 廣東地區(qū)豬鏈球菌2型的毒力基因類(lèi)型Tab．2 Detection of virulence genes in Ss2in Guangdong

圖1 部分菌株夾膜多糖基因片段（cps2J）結(jié)果 －450bpFig．1 Strains capsular polysaccharide gene fragment（cps2J）－450bpThe 1－7are part of strains from patients；8－10 are part of isolates from sick pigs

圖2 廣東地區(qū)豬鏈球菌2型菌株MLST分型聚類(lèi)圖Fig．2 MLST type cluster map of Streptococcus suis type 2in Guangdong Province

3 討 論

豬鏈球菌2型菌株曾引起我國(guó)1998年江蘇省和2005年四川省的部分地區(qū)的人感染豬鏈球菌病疫情的暴發(fā)流行。廣東省豬鏈球菌在豬間的流行早有報(bào)告，但從病原學(xué)上證實(shí)人感染豬鏈球菌2型尚屬首次［6］，且與江蘇、四川人感染豬鏈球菌病疫情暴發(fā)不同，廣東地區(qū)的豬鏈球菌2型菌株均來(lái)源于散發(fā)的病例和病豬。

研究發(fā)現(xiàn)并不是所有的豬鏈球菌2型菌株都具有致病性，其致病力取決于它的毒力因子，根據(jù)菌株毒力因子的差異，將其分為強(qiáng)毒力株、弱毒力株和無(wú)毒力株，其致病機(jī)理目前還不很清楚，但普遍認(rèn)為其致病力的差異與該菌株的毒力因子分布有著密切的關(guān)系［7］。Cps2J是豬鏈球菌2型菌株抵抗巨噬細(xì)胞吞噬的重要物質(zhì)，在豬鏈球菌致病過(guò)程中有重要作用，也是豬鏈球菌進(jìn)行分型的標(biāo)志。Smith等［8］研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)插入突變得到的無(wú)莢膜的等位基因突變株在體外很容易被豬肺泡巨噬細(xì)胞攝入，更重要的是，通過(guò)鼻腔接種無(wú)菌仔豬的突變株對(duì)其完全無(wú)致病性，由此可見(jiàn)，莢膜多糖與菌株的致病力有關(guān)。

mrp與ef也是豬鏈球菌2型菌株重要的毒力因子，曾巧英等［9］研究證明mrp可單獨(dú)作為豬鏈球菌2型菌株的毒力因子。豬鏈球菌血清型眾多，ef與血清型有相關(guān)性，ef是一種粘附素，能黏附上皮細(xì)胞并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞融合和凋亡［10］。Henk J等［11］研究歐洲的豬鏈球菌菌株結(jié)果顯示：豬鏈球菌血清1型、2型、1／2型和14型菌株表達(dá)ef蛋白的百分率很高，菌株的毒力可能與ef相關(guān)。本研究中除了1株來(lái)自病豬的菌株為ef陰性外，其余菌株均為ef陽(yáng)性。由于mrp和ef在強(qiáng)毒力菌株中檢出率很高，在無(wú)毒力菌株中檢出率很低，因而攜帶mrp和ef常被認(rèn)為是豬鏈球菌2型高致病性的標(biāo)志［12］。Vecht U［13］等研究發(fā)現(xiàn)mrp＋、epf＋ 的表現(xiàn)型菌株感染小豬時(shí)可以引起典型的腦炎、多發(fā)性漿液炎及多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，而mrp－、ef－的表現(xiàn)型菌株對(duì)豬則沒(méi)有致病力。本研究中的菌株mrp＋、epf＋ 高達(dá)90．9%（20／22），其中1株來(lái)自病豬的菌株為mrp－、ef－，這可能是由別的毒力基因所導(dǎo)致發(fā)病。

Sly對(duì)Hep22細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和Vero細(xì)胞均具有一定的毒性作用，且經(jīng)純化后溶血素免疫的小鼠和豬均能耐受強(qiáng)毒力株的攻擊，所以推測(cè)其可能也是豬鏈球菌2型的一種重要的致病因子，也是一種保護(hù)性抗原［14］。然而，豬鏈球菌2型的溶血素基因分布具有很強(qiáng)的地域性，來(lái)自歐洲的大多數(shù)菌株能產(chǎn)生溶血素，而來(lái)自北美的菌株不產(chǎn)生溶血素，但仍然具有致病性［1］。本研究中的菌株sly＋ 只有50．0%（11／22）。據(jù)相關(guān)研究證實(shí)基于gdh蛋白的檢測(cè)可區(qū)分豬鏈球菌2型的強(qiáng)毒力株、弱毒力株和無(wú)毒力株，同時(shí)，gdh也與豬鏈球菌的種屬有關(guān)［15］。

本研究通過(guò)對(duì)廣東地區(qū)病人、病豬的豬鏈球菌2型分離株進(jìn)行上述5種主要毒力因子的PCR檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)22株菌株包含了5種毒力基因型，其中cps2J＋／mrp＋／sly＋／gdh＋／ef＋型別為病人及病豬菌株所共有，共占45．5%（10／22），cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh－／ef＋、cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh＋／ef＋為病人菌株所特有，各占27．3%（6／22）、18．2%（4／22），cps2J＋／mrp－／sly＋／gdh＋／ef＋、cps2J＋／mrp－／sly－／gdh＋／ef－為病豬菌株所特有，各占4．5%（1／22）、4．5%（1／22），這就提示我省目前豬鏈球菌2型流行菌株的毒力基因型主要為同時(shí)具有上述5種毒力基因的基因型，但低于趙冉等［16］研究的5種毒力基因96% 均為陽(yáng)性的結(jié)果。本次研究的病例中有兩例（毒力基因型別分別為：cps2J＋／mrp＋／sly＋／gdh＋／ef＋、cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh－／ef＋）死亡，共占本次研究的毒力基因型別的72．8%（16／22）。但由于分離的菌株數(shù)量較少，且收集到病例、病豬的臨床表現(xiàn)和病理改變資料也有限，因此廣東地區(qū)的豬鏈球菌2型分離株是否還有更多的毒力基因型，各種毒力基因型的菌株與臨床病人或病豬的臨床表現(xiàn)和病理改變有何關(guān)聯(lián)等，還有待對(duì)更多的豬鏈球菌2型分離株進(jìn)行檢測(cè)研究。本研究結(jié)果表明廣東地區(qū)豬鏈球菌2型菌株毒力基因型呈現(xiàn)多樣化，部分毒力基因型為病人及病豬所共有，cps2J＋／mrp＋／sly＋／gdh＋／ef＋型別是目前廣東地區(qū)豬鏈球菌2型菌株毒力基因型別的優(yōu)勢(shì)型別。

多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（multilocus sequence typing，MLST）是基于PCR擴(kuò)增、基因測(cè)序的基因分型方法。MLST方法具有很高的分辨能力，不需用參考菌株對(duì)實(shí)驗(yàn)室間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，適用于流行病學(xué)研究［17］。并且可以通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行快速的數(shù)據(jù)共享，有利于全球范圍的流行病學(xué)的比較與分析。King S J等［18］對(duì)英國(guó)294株豬鏈球菌分離株進(jìn)行了MLST分析，共獲得了92個(gè)序列型（ST），其中ST1克隆復(fù)合物是最主要的ST分組，它包含了全世界各地的絕大多數(shù)的高致病性分離株，ST1型多來(lái)自腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和敗血癥的樣本，ST27、ST87型則主要來(lái)自肺臟，與臨床背景相關(guān)良好。Princivalli M S等［19］對(duì)意大利2003－2007年分離的菌株研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)ST1型主導(dǎo)著這幾年的流行，并且大都攜帶mrp、ef和sly基因。與歐洲報(bào)道相比，我國(guó)分離株則以ST7型為主，其次是ST1型。葉長(zhǎng)蕓等對(duì)國(guó)內(nèi)兩次暴發(fā)（1998年江蘇、2005年四川）的豬鏈球菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)114株豬鏈球菌中有106株屬于ST7型。王洪敏等［20］的研究表明廣東2005年的5株人源豬鏈球菌2型株菌中有3株屬于ST7型，2株屬于ST1型，其中ST7型與2005年四川疫情株相同，而病人的ST1型與香港地區(qū)發(fā)現(xiàn)的豬鏈球菌相同；這與四川省暴發(fā)的人間豬鏈疫情明顯不同，四川僅由單一的ST7型豬鏈球菌克隆引起。研究表明，ST7型刺激T細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)致炎因子釋放的能力比歐洲流行株ST1型更強(qiáng)［21］。不難看出，MLST最大特點(diǎn)是不同的實(shí)驗(yàn)室獲得的結(jié)果可以比較，易于統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)化，并可經(jīng)互聯(lián)網(wǎng)共享，現(xiàn)已有許多學(xué)者將該技術(shù)用于流行病學(xué)研究中［22］。

此研究中對(duì)分離到的豬鏈球菌2型菌株進(jìn)行MLST分析發(fā)現(xiàn)22株菌分布在3個(gè)ST型別：11株（病人9株、病豬2株）屬于ST1型，10株（病人8株、病豬2株）屬于ST7型，1株來(lái)自病豬的豬鏈球菌2型屬于ST28型，其中ST1、ST7型為病人和病豬菌株所共有，均同屬于ST1克隆復(fù)合物，顯示兩者菌株間的親緣關(guān)系極近。ST28型為病豬所特有，病豬菌株的ST型別呈現(xiàn)多樣化，部分型別與病人菌株出現(xiàn)交叉。

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