盧端萍，陳碩，王勇，蔣婷婷

(1.福建省藥品檢驗(yàn)所，福建 福州 350001；2.福建省立醫(yī)院，福建 福州 350001)

HPLC測(cè)定赤芝水提取物中靈芝酸A含量

盧端萍1*，陳碩1，王勇1，蔣婷婷2

(1.福建省藥品檢驗(yàn)所，福建 福州 350001；2.福建省立醫(yī)院，福建 福州 350001)

目的：建立赤芝水提取物中靈芝酸A的含量測(cè)定方法。方法：采用C8柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)，以乙腈-0.1%醋酸進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：256 nm，柱溫：22 ℃。結(jié)果：樣品中靈芝酸A分離較好，靈芝酸A的線性范圍為15.32～306.4 μg·mL-1(r=1.000 0)，平均回收率為99.4%。結(jié)論：不同產(chǎn)地的赤芝水提取物中靈芝酸A含量有一定的差別，但該法簡(jiǎn)便、易行，為赤芝水提取物質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

高效液相；赤芝水提取物；靈芝酸A

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.)Karst.或紫芝GanodermasinenseZhao，Xu et Zhang的干燥子實(shí)體，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘的功能。用于心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘，虛勞短氣，不思飲食[1]。靈芝中主要含有多糖[2-5]、三萜[6-9]、核苷[10]、生物堿[11]、黃酮[7]、氨基酸及微量元素等多種化學(xué)成分，具有護(hù)肝、抗炎、抗高血壓、抗腫瘤、降血脂、免疫調(diào)節(jié)[12]等功能。赤芝水提取物是靈芝類保健食品的主要原料之一，目前靈芝類產(chǎn)品質(zhì)量控制大多用紫外分光光度法測(cè)定總?cè)苹虼侄嗵呛縖13-14]，但紫外分光光度法專屬性不強(qiáng)；有文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道采用核苷類成分作為靈芝類產(chǎn)品的質(zhì)控指標(biāo)，但真菌類藥用植物中均有核苷類成分，因此核苷類成分也不適宜作為靈芝類保健食品的質(zhì)控指標(biāo)。三萜類成分作為靈芝的主要活性成分之一[17-19]，有必要對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，也有文獻(xiàn)報(bào)道[20-25]采用高效液相色譜法測(cè)定靈芝子實(shí)體或靈芝孢子粉中靈芝三萜類成分的含量。作者以靈芝的主要功效成分——靈芝三萜中含量較高的靈芝酸A作為質(zhì)控指標(biāo)，建立了赤芝水提物中靈芝酸A的含量測(cè)定方法，為靈芝類保健食品的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀(島津公司)，超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，超純水器(賽多利斯)。

1.2 試藥

靈芝酸A對(duì)照品(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所，純度>98%)，赤芝水提取物D1～D10(福建仙芝樓生物科技有限公司在全國(guó)不同產(chǎn)地收集靈芝子實(shí)體后，采用相同的提取工藝，即水提、濃縮、干燥制得)。乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB C8(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%醋酸為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速為1mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為256 nm。柱溫：22 ℃；進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按靈芝酸A計(jì)算應(yīng)不低于5 000。在此色譜條件下，樣品中靈芝酸A與其他組分分離效果較好，見圖1。

表1 梯度洗脫程序

A.靈芝酸A對(duì)照品;B.赤芝水提取物樣品；1.靈芝酸A圖1 赤芝水提取物及對(duì)照品HPLC圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取靈芝酸A對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含靈芝酸A 90 μg·mL-1的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品0.2 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理10 min，放冷，加甲醇定容至刻度，濾過(guò)，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取靈芝酸A對(duì)照品適量，加甲醇分別制成濃度為15.32，30.64，61.28，153.2，306.4 μg·mL-1的溶液，分別吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積(mAU)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的對(duì)照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=10.655X+1.55，r=1.000 0，表明靈芝酸A在15.32～306.4 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的赤芝水提取物(D1)樣品6份，分別制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，測(cè)得靈芝酸A平均含量為8.69 mg·g-1，RSD=0.35%，表明該法具有良好的重復(fù)性。

2.6 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的同一批號(hào)赤芝水提取物(D1)樣品，采用加樣回收試驗(yàn)，精密加一定量靈芝酸A對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法和色譜條件測(cè)定，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液分別于0，2，4，8，16，24 h進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定靈芝酸A含量，結(jié)果RSD=0.67%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 靈芝酸A回收率試驗(yàn)

注：靈芝酸A對(duì)照品加入量均為0.924 0 mg

2.8 樣品測(cè)定

對(duì)10批赤芝水提取物樣品按上述含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 赤芝水提物10批樣品含量測(cè)定結(jié)果 /mg·g-1

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)曾采用乙腈-水梯度洗脫，結(jié)果分離效果較差，靈芝酸A對(duì)照品峰形很差，后采用乙腈-2%醋酸[17]梯度洗脫，結(jié)果靈芝酸A色譜峰中含有一較小的雜質(zhì)峰，導(dǎo)致回收率偏低，經(jīng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相不同比例，分離效果仍不理想，后采用本文流動(dòng)相梯度洗脫程序，考察了不同濃度的醋酸(0.1%，0.5%，1%，2%)，結(jié)果顯示醋酸濃度對(duì)分離結(jié)果影響較大，隨著醋酸濃度增大，靈芝酸A與雜質(zhì)峰分離越差，本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相中醋酸濃度定為0.1%。

3.2 柱溫選擇

本實(shí)驗(yàn)曾考察不同柱溫(22，25，30 ℃)分離效果影響，結(jié)果表明柱溫對(duì)分離效果影響很大，柱溫為30 ℃時(shí)，靈芝酸A與雜質(zhì)峰分離不開，柱溫25 ℃時(shí)，分離效果有所改善，當(dāng)柱溫設(shè)為22℃時(shí)，靈芝酸A與前后雜質(zhì)峰均能較好地分離。

3.3 提取溶劑的選擇

曾考察甲醇和三氯甲烷兩種提取溶劑，以甲醇為提取溶劑，靈芝酸A含量較高；以三氯甲烷作為提取溶劑時(shí)，雜質(zhì)較少，但回收率偏高，故本實(shí)驗(yàn)采用甲醇為提取溶劑。

3.4 提取時(shí)間的選擇

曾對(duì)其提取時(shí)間進(jìn)行考察(10，15，20，25 min)，結(jié)果超聲提取10 min，樣品中靈芝酸A已提取完全。

從以上測(cè)定結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地的赤芝水提取物中靈芝酸A含量有一定差別，可能系靈芝不同培養(yǎng)基質(zhì)、生長(zhǎng)環(huán)境、采收季節(jié)等因素影響所致。

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DeterminationofGanodericAcidAinGanodermalucidumWaterExtractsbyHPLC

LU Duan-ping*，CHEN Shuo，WANG Yong，JIANG Ting-ting

(1.FujianInstituteforDrugControl，F(xiàn)uzhou350001，China； 2.FujianProvincialHospital，F(xiàn)uzhou350001，China)

Objective：To establish a method for determination of ganoderic acid A inGanodermasinensis water extracts by using high performance liquid chromatograph with Diode array detector.Methods：A C8column(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)was used，the mobile phase consisted of acetonetrile-0.1% acetic acid by gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 256 nm and column temperature was maintained at 22 ℃.Results：The calibration curves of ganoderic acid A was linear in the range of 15.32～306.4 μg·mL-1(r=1.000 0).The average recovery was 99.4%.Conclusion：There is some difference in ganoderic acid A content of different originGanodermalucidumwater extracts，but this method is simple and reliable for quality control ofGanodermalucidumwater extracts.

Ganodermalucidumwater extracts； HPLC； Ganoderic acid A

2012-10-11)

*

盧端萍，Tel:(0591)87622209，E-mail：ldp18@tom.com