許 盈，鄭 宓，李蘇平，蘇燕評，楊 漸，劉 銘，俞昌喜

鉤吻素子（Koumine），分子式C20H22N2O，相對分子質(zhì)量306．3，是我國歷史悠久的藥用植物鉤吻（GelsemiumelegansBenth．）主要活性成分生物堿中含量最高且毒性較低的一種生物堿［1－3］，其藥理作用及潛在的臨床應(yīng)用價值日益受到關(guān)注。有報道，鉤吻素子具有鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗腫瘤、抗應(yīng)激和抗銀屑病等藥理作用，具有創(chuàng)制新型藥物的潛能［4－8］。然而，藥動學(xué)是成藥性評價的重要指標(biāo)，鉤吻素子的藥動學(xué)特征還有待于研究。本研究報道高效液相色譜 （high performance liquid chromatorgraphy，HPLC）測定血液和組織樣品鉤吻素子的方法，進(jìn)而研究單次灌胃給予鉤吻素子的大鼠體內(nèi)藥動學(xué)和組織分布，從而獲得口服用藥的藥動學(xué)資料，為鉤吻素子深入開展毒理、藥效和臨床研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 主要試劑和儀器 鉤吻素子由本實(shí)驗(yàn)室自閩產(chǎn)野生鉤吻植物中提取，純度99．1%；甲醇（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氨水（汕頭市西隴化工廠有限公司）。高效液相色譜儀（LC－20A，日本島津公司）；電子分析天平（BP310S型，北京塞多利斯天平公司）；氮?dú)獯蹈蓛x（HGC－24A型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；臺式高速離心機(jī)（TGL－16C型，上海安亭科學(xué)儀器廠）；旋渦混合儀（WH－2微型，上海滬西分析儀器廠）；自動勻漿器（Art－Miccra D－8型，德國 MICCRA公司）。

1．1．2 動物 雄性SD大鼠，6～7周齡，體質(zhì)量180～200g，清潔級［上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（滬）2007－0005］。實(shí)驗(yàn)前禁食12h，不禁水。

1．2 方法

1．2．1 樣品采集與預(yù)處理 血漿樣品采集與預(yù)處理：大鼠6只，灌胃給予15mg／kg鉤吻素子，于給藥后第5，9，12，15，30，45，60，150，240，330和420 min眼眶靜脈取血約0．5mL于肝素處理的試管中，4 000r／min離心5min，取100μL 血漿，加5mol／L氫氧化鈉溶液10μL調(diào)pH至10～12，加1mL乙酸乙酯，渦旋混勻5min，10 000r／min離心10min，取上清60℃氮?dú)鈸]干，殘渣以100μL流動相復(fù)溶，0．25μm微孔濾膜過濾，取濾液10μL進(jìn)樣。

組織樣品采集與預(yù)處理：大鼠18只，隨機(jī)分成3組，每組6只。大鼠灌胃給予15mg／kg鉤吻素子，3組大鼠分別于灌胃給藥后第5，15和60min斷頭處死，取肝、腎、肺、腦、睪丸、骨骼肌、胃、小腸、體脂、心、脾組織，生理鹽水沖洗（其中小腸和胃需去除內(nèi)容物），濾紙吸干，稱質(zhì)量，按1∶1（W／V）加入生理鹽水冰浴勻漿，取100μL勻漿液進(jìn)行預(yù)處理，方法同上述血漿樣品的預(yù)處理。

1．2．2 HPLC色譜條件 色譜柱：Amethyst C18柱（150mm×4．6mm，5μm）；柱溫：30℃。血液樣品檢測流動相：甲醇∶水∶氨水＝55∶45∶0．05（V／V）；組織樣品檢測流動相：甲醇∶水∶氨水＝45∶55∶0．05（V／V）；流速1．0mL／min。紫外檢測波長：256nm。

1．2．3 方法學(xué)確證 為驗(yàn)證HPLC測定血漿樣品鉤吻素子含量的方法學(xué)，進(jìn)行專屬性、線性關(guān)系及靈敏度、精密度、回收率和穩(wěn)定性試驗(yàn)。為驗(yàn)證HPLC測定組織樣品鉤吻素子含量的方法學(xué)，進(jìn)行專屬性、線性關(guān)系、精密度和回收率試驗(yàn)。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用x±s表示。選用Kinetia 4．4藥代動力學(xué)軟件（Thermo Electron公司）計算藥動學(xué)參數(shù)。

2 結(jié) 果

2．1 HPLC測定生物樣品鉤吻素子含量的方法學(xué)確證

2．1．1 鉤吻素子血漿樣品濃度測定方法確證 本色譜條件下鉤吻素子的保留時間為9．2min，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對檢測無干擾，方法的專屬性良好；在0．06～10．00μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（表1），定量限為0．06μg／mL；鉤吻素子0．08，2．00和10．00μg／mL的日內(nèi)和日間精密度 RSD均＜9%，鉤吻素子0．08，2．00和10．00μg／mL提取回收率為80．03%～83．55%，方法回收率為99．21%～110．36%，鉤吻素子0．08，2．00和10．00 μg／mL室溫、凍融和長期保存穩(wěn)定性的測定結(jié)果變化均在允許范圍內(nèi)。

2．1．2 鉤吻素子組織樣品濃度測定方法確證 本色譜條件下鉤吻素子的保留時間為19．7min，組織中的內(nèi)源性物質(zhì)對檢測無干擾，方法的專屬性良好；在0．08～5．00μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（表1）；鉤吻素子0．08，1．00和5．00μg／mL的日內(nèi)和日間精密度RSD均＜8%，鉤吻素子0．08，1．00和5．00μg／mL提取回收率為64．20%～76．82%，方法回收率為91．87%～109．25%。

表1 大鼠血漿和組織鉤吻素子含量HPLC測定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)Tab 1 Standard curves and correlation coefficients of Koumine concentrations in rat plasma and tissues measured by HPLC method

2．2 鉤吻素子在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué) 鉤吻素子的血藥濃度－時間曲線見圖1。大鼠單次灌胃給予15mg／kg鉤吻素子，約15min后鉤吻素子血藥濃度達(dá)峰；隨后血藥濃度迅速下降，而在灌胃給藥1h后血藥濃度下降緩慢。經(jīng)Kinetica 4．4藥代動力學(xué)軟件分析處理，以AIC最小原則為指標(biāo)，結(jié)果表明灌胃給予鉤吻素子在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)符合二室模型（權(quán)重 W為1），其主要藥物動力學(xué)參數(shù)如下：計算的達(dá)峰時間為（19．95±0．53）min，計算的峰濃度為（0．69±0．03）μg／mL，表觀分布容積為（10．45±0．36）L／kg，分 布 相 半 衰 期 為 （7．65±0．47）min，消除相半衰期為（234．11±17．37）min，清除率為（0．031±0．003）L·min－1·kg－1，消除速率常數(shù)為（0．011±0．001）min－1，曲線下面積AUC0→t為（142．35±5．86）mg·min·L－1，曲線下面積AUC0→∞為（176．78±7．57）mg·min·L－1。

2．3 鉤吻素子在大鼠體內(nèi)的組織分布 大鼠單次灌胃給予15mg／kg鉤吻素子后5，15和60min的組織分布情況見圖2。結(jié)果顯示，鉤吻素子組織分布廣泛，甚至可分布于腦和睪丸等組織，組織濃度在胃、體脂、肝、腎、脾、小腸較高；分布速度快，給藥5min后多數(shù)組織濃度已達(dá)峰。隨后，多數(shù)組織中的藥物含量隨時間推移而下降，但肝臟和小腸含量在給藥后15min最高。給藥1h后多數(shù)組織藥物含量較低，特別是骨骼肌和睪丸已低于檢測限。

圖1 大鼠單次灌胃給予鉤吻素子的平均血藥濃度－時間曲線Fig 1 Mean plasma concentration－time curve of a single intragastric administration of Koumine in rats

圖2 大鼠單次灌胃給予鉤吻素子的組織分布圖Fig 2 Distribution of Koumine in rats after a single intragastric administration

3 討 論

鉤吻素子生物樣品的預(yù)處理方法，Chen等采用甲醇沉淀的方法［9］，筆者則采用溶劑萃取的方法。為建立適宜的生物樣品預(yù)處理方法，筆者前期考察了蛋白沉淀劑（甲醇、乙腈和丙酮）、萃取溶劑（正己烷、乙醚、乙酸乙酯和氯仿）和血漿樣品pH值（pH＝7～9，pH＝10～12和pH＞13）對提取回收率的影響，發(fā)現(xiàn)上述3種常見蛋白沉淀劑的提取回收率較低（39．1%～70．6%），特別是甲醇最低（提取回收率僅39．1%±4．1%，RSD：3．6%）；溶劑萃取效率較高，尤以乙酸乙酯為高（提取回收率：80．0%±3．3%，RSD：3．0%），因此樣品預(yù)處理方法選擇溶劑萃取的方式；進(jìn)而考察了pH值的影響，發(fā)現(xiàn)pH＝10～12時，萃取效率最高（提取回收率：82．3%±2．0%，RSD：1．7%），從而優(yōu)選建立1．2．1項(xiàng)下的樣品預(yù)處理方法。

血漿鉤吻素子的含量測定方法，Chen等采用超高效液相色譜－質(zhì)譜（Ultra－performance liquid chromatography－mass spectrometry，UPLC－MS／MS）法［9］，本研究則采用HPLC法，盡管前者保留時間較短（2．6min），本法保留時間相對長些，但9．2min仍可接受；前者檢測限稍低（0．025μg／mL），本法（0．06μg／mL）雖高于前者，但仍在同一數(shù)量級，而且對于初步血藥濃度檢測已滿足；本法線性（范圍：0．06～10μg／mL，相關(guān)系數(shù)：0．999 3）與前者（范圍：0．025～15μg／mL，相關(guān)系數(shù)：0．999 7）相當(dāng)，但本法精密度（日內(nèi)和日間精密度RSD分別為3．8%～4．2%和5．0%～8．8%）優(yōu)于前者（日內(nèi)和日間精 密度 RSD 分 別 為4．8%～8．7%和6．7%～14．1%），本法提取回收率（80．0%～83．6%）也優(yōu)于前者（70．0%～78．9%）；前者對儀器要求高，需要有UPLC和MS儀器，設(shè)備和耗材昂貴，而本法所需HPLC色譜儀－紫外檢測器屬常規(guī)儀器，因此本法易于廣泛應(yīng)用。

組織鉤吻素子的含量測定方法，本研究系在血漿樣品測定方法上優(yōu)化而來。用血漿樣品的色譜條件檢測組織樣品，發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)源性物質(zhì)可干擾鉤吻素子的檢測，通過降低甲醇的比例，流動相從甲醇∶水∶氨水＝55∶45∶0．05（V／V）改為甲醇∶水∶氨水＝45∶55∶0．05（V／V），可提高鉤吻素子的分離度，避免內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾。楊櫻等報道HPLC測定大鼠肝微粒體中鉤吻素子含量的方法，但該方法保留時間約為40min，等待時間長，所用流動相為乙腈∶0．1%三乙胺＝20∶80（V／V），其中乙腈毒性較高，三乙胺雖可以作為掃尾劑減少峰拖尾，但也增加了分析方法的復(fù)雜性和損傷色譜柱的可能性［10－11］。本法保留時間約20min，時間短，流動相為甲醇∶水∶氨水＝45∶55∶0．05（V／V），毒性較低，且本法可用于測定機(jī)體大多數(shù)組織鉤吻素子的含量，因此本法更優(yōu)。

利用本研究建立的血漿鉤吻素子含量HPLC檢測法，進(jìn)行鉤吻素子單次灌胃給予大鼠的體內(nèi)藥動學(xué)研究，觀察到鉤吻素子在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)符合二室模型，達(dá)峰時間短，提示鉤吻素子的吸收迅速，起效快；表觀分布容積大，提示鉤吻素子廣泛分布，與實(shí)際組織分布測定的結(jié)果相吻合；消除半衰期約為4h，與筆者所在課題組觀察到鉤吻素子單次用藥對神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛持效時間5．5h相接近（另文報道）。本研究報道的單次灌胃給予大鼠15mg／kg鉤吻素子的藥動學(xué)參數(shù)與Chen等單次靜脈注射給予大鼠20mg／kg鉤吻素子的藥動學(xué)參數(shù)比較［9］，Ke較接近，但半衰期和表觀分布容積數(shù)據(jù)有差異，本研究為（234．11±17．37）min和（10．45±0．36）L／kg，Chen等為（42．9±18．9）min和（3．646±1．950）L／kg。數(shù)值差異原因推測可能有以下幾個方面：（1）動物來源不同；（2）給藥劑量不同；（3）擬合模型不同，本研究采用二室模型，Chen等采用非房室模型。利用本研究測得灌胃給藥鉤吻素子的AUC0→∞（176．78mg·min·L－1）和Chen等測得靜脈注射鉤吻素子的 AUC0→∞（352．071mg·min·L－1），按絕對生物利用度（F）的計算公式：F＝（AUC口服×靜脈注射劑量）÷（AUC靜脈×口服劑量）×100%，估算鉤吻素子口服給藥的生物利用度為66．95%，提示鉤吻素子可能具有首過消除。

利用本研究建立的組織鉤吻素子含量HPLC檢測法，進(jìn)行鉤吻素子單次灌胃給予大鼠的組織分布研究，結(jié)果顯示鉤吻素子分布迅速且廣泛，這與大多數(shù)生物堿表觀分布容積較大的特點(diǎn)是相符的［12］。組織分布量以胃、小腸、肝和脾為高，即消化系統(tǒng)的分布較高，這可能是鉤吻素子對消化道腫瘤有較好治療作用的藥動學(xué)基礎(chǔ)［6，13］。特別注意到腦組織有鉤吻素子的分布且消除相對較慢，提示鉤吻素子可以透過血腦屏障，而且在中樞濃度可以維持較恒定，提示鉤吻素子可能具有中樞性作用，這與本課題組報道鉤吻素子具有顯著的抗神經(jīng)病理性疼痛、抗焦慮效應(yīng)是相吻合的［4－5］。鉤吻素子在其他組織消除快，提示鉤吻素子可能不易產(chǎn)生在組織中的蓄積中毒。

綜上所述，本研究報道了HPLC法測定生物樣品鉤吻素子含量的方法，該方法穩(wěn)定、可靠、易于廣泛應(yīng)用；在此基礎(chǔ)上觀測獲得鉤吻素子口服藥動學(xué)參數(shù)和組織分布研究資料，為可能的鉤吻素子新藥創(chuàng)制提供科學(xué)依據(jù)。

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