文 / 劉顯庭 張 昊 郭慧媛 任發(fā)政

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部-北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

干酪是以乳、稀奶油、脫脂乳或部分脫脂乳、酪乳或這些原料的混合物為原料，經(jīng)凝乳并排出乳清而制成的新鮮或發(fā)酵成熟的乳制品。按不同的凝乳方式，干酪可分為酶凝型干酪與酸凝型干酪。目前，大部分干酪屬于酶凝型干酪，即通過凝乳酶的作用促進(jìn)凝乳的形成。凝乳酶的作用關(guān)系到干酪品質(zhì)的好壞與干酪生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，在干酪生產(chǎn)中的作用至關(guān)重要。目前，隨著干酪產(chǎn)量的快速增長(zhǎng)，傳統(tǒng)的小牛皺胃凝乳酶的生產(chǎn)已經(jīng)處于供不應(yīng)求的狀態(tài)，探尋新來源凝乳酶成為了目前研究的熱點(diǎn)。

1 凝乳酶概述

凝乳酶在干酪生產(chǎn)中的使用可以追溯到約公元前6000年，舊石器時(shí)代的人們用小牛的皺胃作為容器盛裝牛乳的過程中發(fā)現(xiàn)牛乳凝集現(xiàn)象，從而使得皺胃凝乳酶在干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用成為了可能[1]。凝乳酶按來源可分為動(dòng)物性凝乳酶、植物性凝乳酶、微生物凝乳酶、基因工程重組凝乳酶四類。

動(dòng)物性凝乳酶是一類傳統(tǒng)的凝乳酶，主要從新生反芻動(dòng)物如小牛的第四個(gè)胃即皺胃中提取。目前，由于小牛皺胃酶等動(dòng)物性凝乳酶在干酪生產(chǎn)中得到廣泛地應(yīng)用，從反芻動(dòng)物中獲取小牛皺胃酶等動(dòng)物性凝乳酶已經(jīng)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)[2]。一般從新生小牛皺胃中提取的皺胃酶由凝乳酶（EC 3.4.23.4）及部分胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）、胃蛋白酶B（EC 3.4.23.2）、胃亞蛋白酶（EC 3.4.23.3）組成，這類酶都屬于天冬氨酸蛋白酶（EC 3.4.23）。皺胃酶包含凝乳酶與胃蛋白酶，其比例受小牛生長(zhǎng)期、飼養(yǎng)情況影響，在飼養(yǎng)條件良好的情況下小牛皺胃中凝乳酶所占的比例可大于80%[3]。目前生產(chǎn)用皺胃酶中凝乳酶的比例在50%～90%。凝乳酶能特異性水解Κ-酪蛋白產(chǎn)生酪蛋白巨肽，從而形成凝乳，而胃蛋白酶的水解特性并不專一，它能同時(shí)水解含有Phe，Tyr，Leu，Val的肽鍵[4]。動(dòng)物凝乳酶的凝乳活力與蛋白水解能力高，是目前干酪生產(chǎn)中首選的凝乳酶，但是隨著世界干酪產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展壯大，通過宰殺犢牛以獲得凝乳酶的方法已經(jīng)無法滿足生產(chǎn)的需要，因此亟待開發(fā)新來源的凝乳酶。植物性凝乳酶、微生物凝乳酶、基因工程重組凝乳酶都屬于新來源凝乳酶。

植物性凝乳酶是從植物的組織中水浸提取出的一類具有凝乳作用的蛋白酶，目前被廣泛認(rèn)為具有替代傳統(tǒng)凝乳酶的潛力。常見的從無花果樹類中提取的蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等植物性凝乳酶的蛋白水解能力較弱，不能應(yīng)用于干酪生產(chǎn)中[5]。但是少數(shù)植物性凝乳酶在干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用已經(jīng)較為廣泛，如地中海大薊，其在傳統(tǒng)干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用已有數(shù)世紀(jì)的歷史[6]。

微生物凝乳酶是微生物代謝作用產(chǎn)生的一類具有凝乳作用的蛋白酶，能部分應(yīng)用于生產(chǎn)中。與傳統(tǒng)的皺胃酶相比，微生物凝乳酶的生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量大，受氣候、地域、時(shí)間限制小，用其生產(chǎn)凝乳酶成本較低。同時(shí)，由于宗教信仰的原因，微生物凝乳酶生產(chǎn)的干酪更受素食主義者的青睞。目前微生物凝乳酶的主要來源是米黑根毛霉，其作為動(dòng)物性凝乳酶的替代已長(zhǎng)達(dá)40 年。隨著分離與純化技術(shù)的提高，此類凝乳酶已為素食主義者所接受并應(yīng)用于有機(jī)干酪的生產(chǎn)中。但是微生物凝乳酶對(duì)蛋白酶的高降解能力易導(dǎo)致干酪的產(chǎn)率下降。

基因工程重組凝乳酶一般表示為發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶（FPC），是利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的一類具有凝乳作用的蛋白酶。自1990年利用重組DNA技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法得到美國FDA認(rèn)證以來，基因工程發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶在美國廣泛應(yīng)用并在世界范圍內(nèi)逐漸被接受，2006年發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶市場(chǎng)份額占有70%～80%[7]。但是，基于安全的考慮，此類凝乳酶生產(chǎn)的干酪仍然不被部分消費(fèi)者所接受。

由于受反芻動(dòng)物種類、年齡、飼養(yǎng)等的影響，凝乳酶的理化性質(zhì)往往不恒定，而在一定的范圍內(nèi)。如表1所示，凝乳酶的分子量在31～40 kDa之間，其活性同時(shí)受pH值和溫度等的影響。研究表明，凝乳酶在pH值5.5～6.0下最為穩(wěn)定，在pH值 3～4之間，凝乳酶自動(dòng)降解而迅速失活，在pH值>9.8時(shí)凝乳酶則發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)構(gòu)變化而失去活性。當(dāng)凝乳酶所處溫度從45 ℃升到55 ℃時(shí)活性迅速降低，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)凝乳酶活性即喪失。凝乳酶性質(zhì)的差異影響了干酪的品質(zhì)，因此應(yīng)當(dāng)對(duì)不同類凝乳酶的成分進(jìn)行測(cè)定，對(duì)其凝乳活力標(biāo)準(zhǔn)化，以供干酪生產(chǎn)中參數(shù)的調(diào)整。

表1 動(dòng)物性凝乳酶中蛋白酶的主要特征

2 凝乳酶在干酪生產(chǎn)中的作用

2.1 凝乳酶促進(jìn)凝乳的形成

凝乳酶在促進(jìn)凝乳過程中的主要作用對(duì)象是酪蛋白。酪蛋白約占牛乳中蛋白質(zhì)含量的 80%，可分為 αs1、αs2、β 和 Κ-酪蛋白，其質(zhì)量比約為 4︰1︰4︰1.3[14]。牛乳中這四種酪蛋白單體會(huì)與磷酸鈣相互結(jié)合成直徑約為100～300 nm的膠束結(jié)構(gòu)[15～16]。目前，關(guān)于酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)尚無定論，但是大都認(rèn)為其由疏水性的αs-酪蛋白、β-酪蛋白構(gòu)成了膠束內(nèi)部，由親水性的Κ-酪蛋白組成其外部。其中，αs-酪蛋白、β-酪蛋白帶有多個(gè)磷酸根基團(tuán)對(duì)Ca2+敏感，能與Ca2+橋接形成穩(wěn)定的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而Κ-酪蛋白只有一個(gè)磷酸根基團(tuán)，并使Ca2+橋接終止，形成穩(wěn)定的毛發(fā)層結(jié)構(gòu)。同時(shí)，毛發(fā)層的Κ-酪蛋白由副Κ-酪蛋白與帶有負(fù)電的酪蛋白巨肽組成，從而使膠束表面帶有負(fù)電荷。酪蛋白膠束之間通過膠束間毛發(fā)層的空間位阻作用與靜電斥力而穩(wěn)定存在于牛乳中。

在凝乳的過程中，通過凝乳酶的作用可以破壞原本穩(wěn)定的酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)，使得膠束之間發(fā)生聚集而形成凝乳。凝乳酶對(duì)酪蛋白膠束的作用在于特異性的作用于Κ-酪蛋白的第105～106 位的肽鍵位點(diǎn)，水解Κ-酪蛋白成酪蛋白糖巨肽與副Κ-酪蛋白。隨著帶負(fù)電的酪蛋白糖巨肽釋放至乳清，酪蛋白膠束表面的負(fù)電荷減少，膠束間的靜電斥力下降，毛發(fā)層切除致膠束間的空間位阻降低。最終，酪蛋白通過疏水鍵合與Ca2+架橋作用聚集，從而形成凝乳[17]。

不同類的凝乳酶由于水解酪蛋白的能力有所不同，所以凝乳酶作用形成凝乳的時(shí)間不同，達(dá)到切割時(shí)所需彈性模量值的凝乳酶量也不同。Kappeler等人利用基因重組技術(shù)合成的一類多肽的活性是傳統(tǒng)凝乳酶活性的兩倍，所需凝乳時(shí)間短，酶量少。因此，為使生產(chǎn)工藝標(biāo)準(zhǔn)化，必須根據(jù)凝乳酶的活力對(duì)凝乳酶的使用量進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。凝乳酶的活力是指凝乳酶分解Κ-酪蛋白的能力，是凝乳酶最重要的性質(zhì)之一。傳統(tǒng)的凝乳酶活力測(cè)試方法為Soxhlet法，即35 ℃下一體積凝乳酶溶液在40 min內(nèi)使牛乳形成凝乳的體積[18]。目前，針對(duì)山羊凝乳酶、小牛凝乳酶與微生物凝乳酶，已經(jīng)分別建立ISO/IDF199、ISO/IDF157 、ISO/IDF176等凝乳酶活力的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。在32 ℃、pH值6.5下，將牛乳標(biāo)準(zhǔn)化后作為作用基質(zhì)，測(cè)定凝乳酶與標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶的凝乳活力并進(jìn)行比較，凝乳酶的活力單位表示為國際凝乳活力單位（IMCU）。最近的研究中，Cortellino等人利用高效液相色譜法分離了小牛皺胃酶中的胃蛋白酶與凝乳酶，并測(cè)定了其活力。其結(jié)果與IDF標(biāo)準(zhǔn)使用的方法比較并無差異，說明IDF標(biāo)準(zhǔn)所使用的方法可靠、簡(jiǎn)便、迅速，能準(zhǔn)確地反映出凝乳酶的活力[19]。

2.2 凝乳酶對(duì)干酪成熟期蛋白水解的影響

除促進(jìn)凝乳形成外，凝乳酶對(duì)于干酪獨(dú)特風(fēng)味的形成有著重要的作用。在凝乳形成后，大部分凝乳酶會(huì)隨著乳清而排出，而只有少量的凝乳酶殘留在凝塊當(dāng)中，凝塊當(dāng)中凝乳酶的量受凝乳酶種類、排乳清時(shí)溫度、pH值及凝塊水分的影響，在0%～30%范圍內(nèi)[20]。在干酪的成熟期，隨著pH值與NaCl濃度的變化，殘留的凝乳酶會(huì)作用于αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白的多個(gè)鍵位，使其分解形成短肽與氨基酸。目前有關(guān)凝乳酶如何影響干酪成熟期的報(bào)道較多，其共同表明凝乳酶主要在成熟的早期起作用[21～22]。有研究表明，將凝塊加熱至45～60 ℃后，干酪成熟期的αs-酪蛋白降解明顯減少，說明凝乳酶加速了αs-酪蛋白的降解[23]。Hynes等人的研究表明，αs-酪蛋白的降解速度與凝乳酶的使用量直接相關(guān)，且αs-酪蛋白對(duì)于軟質(zhì)奶酪特征風(fēng)味與質(zhì)構(gòu)具有很大作用，而在硬質(zhì)或半硬質(zhì)干酪的生產(chǎn)中，殘留凝乳酶的活力多由凝塊的加熱溫度決定[24]。

凝乳酶的種類影響了干酪風(fēng)味的形成，2009年Bansal的研究表明，基因工程凝乳酶與小牛皺胃凝乳酶相比，二者在組分與產(chǎn)品pH值上無差異，而在αs-酪蛋白的降解上，小牛皺胃酶的苦味、硫磺味較弱[25]。即使同屬于動(dòng)物性的凝乳酶也存在著明顯差異，2004年P(guān)rieto用小山羊皺胃凝乳酶替代小牛皺胃凝乳酶，其結(jié)果表明αs-酪蛋白的降解明顯減弱，成熟過程中干酪三氯乙酸可溶性氮含量的增加延遲[26]。因此，凝乳酶的種類、成分對(duì)干酪成熟期蛋白質(zhì)的分解有顯著的影響。

由于部分凝乳酶特別是糊狀凝乳酶中還含有脂肪酶等，因此還能分解乳脂肪產(chǎn)生游離脂肪酸。有研究表明，在部分意大利干酪如菠蘿伏洛干酪、佩科里諾干酪的生產(chǎn)中，在脂肪分解酶的作用下形成了干酪的特征性風(fēng)味[27]。Virto等人發(fā)現(xiàn)在羔羊皺胃酶內(nèi)的脂肪分解酶作用下，脂肪分解產(chǎn)生游離脂肪酸，從而形成了干酪銳利、辛辣的風(fēng)味[28]，并使游離氨基酸的釋放延遲[29]。這種脂肪酶包含前胃酯酶與胃酯酶，其活性與羔羊的飼養(yǎng)等因素有關(guān)，有研究指出在飼料中加入益生菌后，從羔羊皺胃中提取的糊狀凝乳酶中脂肪酶的活性增高[30～31]。

3 凝乳酶在干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

聯(lián)合國糧農(nóng)組織的數(shù)據(jù)顯示，1961～2010年期間，世界干酪生產(chǎn)量平均年增長(zhǎng)率達(dá)3.5%，高增長(zhǎng)的干酪需要更多的凝乳酶。但是由于新生小牛皺胃數(shù)量有限，使得目前凝乳酶的生產(chǎn)供不應(yīng)求，小牛皺胃凝乳酶僅能滿足凝乳酶的需求量的20%～30%[32]，約80%的小牛皺胃酶用于傳統(tǒng)干酪的生產(chǎn)中。最近幾年來，對(duì)于其它反芻動(dòng)物皺胃酶尤其是小羊皺胃酶的研究逐漸成為熱點(diǎn)，但一直未商業(yè)化生產(chǎn)。有研究在具有原產(chǎn)地保護(hù)的意大利菠蘿伏洛干酪中使用小羊皺胃酶，其結(jié)果表明，由于小羊皺胃酶含有脂肪分解酶從而分解脂肪產(chǎn)生游離脂肪酸，使干酪形成銳利、辛辣刺激的風(fēng)味[33]。因此，盡管傳統(tǒng)的動(dòng)物性凝乳酶在市場(chǎng)上供不應(yīng)求，但是由于不同類的凝乳酶作用不同，特別是對(duì)于形成特征性風(fēng)味的作用有差異，消費(fèi)者習(xí)慣了傳統(tǒng)干酪的風(fēng)味而不能接受這類酶在干酪中應(yīng)用。因此，有些傳統(tǒng)的凝乳酶在有原產(chǎn)地保護(hù)標(biāo)志干酪的生產(chǎn)中仍具有不可替代的作用。

然而在我國由于干酪產(chǎn)業(yè)的起步較低，目前生產(chǎn)重心主要停留在再制干酪加工與進(jìn)口產(chǎn)品的分裝上，且傳統(tǒng)干酪如云南乳扇、廣東姜撞奶等屬于酸凝型干酪，對(duì)凝乳酶的需求量較小。因此，凝乳酶在我國尚未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。但是隨著我國奶業(yè)的高速發(fā)展與乳制品生產(chǎn)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，干酪已經(jīng)成為中國乳品產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)的熱點(diǎn)及新的消費(fèi)增長(zhǎng)點(diǎn)。而凝乳酶作為干酪生產(chǎn)用的酶制劑，在干酪生產(chǎn)的帶動(dòng)下也必將成為我國研發(fā)與生產(chǎn)的重點(diǎn)之一。

4 小結(jié)與展望

凝乳酶對(duì)于干酪的生產(chǎn)至關(guān)重要，凝乳酶是食品工業(yè)中最為重要的蛋白酶。在目前凝乳酶短缺的情況下，為開發(fā)具有高凝乳活力，低蛋白水解力的凝乳酶，亟待開展有關(guān)新來源凝乳酶在促進(jìn)凝乳形成，促進(jìn)干酪獨(dú)特風(fēng)味形成中作用的研究。同時(shí)，隨著研究的不斷深入，在原產(chǎn)地保護(hù)干酪生產(chǎn)之外，發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的應(yīng)用必將成為今后產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新方向，也必將對(duì)干酪產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

【基金支持：“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD12B08，2011AA100903）】

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