唐 強(qiáng)，王宏宇，王 艷，邢艷麗，朱路文

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001;2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

缺血性卒中是臨床常見(jiàn)病和多發(fā)病，隨著診療技術(shù)的提高，其死亡率呈降低趨勢(shì)，但后遺癱瘓率仍居高不下［1－2］。因此，如何減輕梗死后功能障礙已成為康復(fù)醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)［3］。缺血早期的微血管痙攣是造成腦損傷加重的重要因素［4］，ET－β受體正是具有強(qiáng)烈血管收縮效應(yīng)物質(zhì)－內(nèi)皮素(ETs)的受體之一［5］，相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明大鼠pMCAO后可導(dǎo)致ETs增加并作用于ET－β受體，使缺血區(qū)微血管痙攣，側(cè)支血流無(wú)力進(jìn)入高壓力的痙攣血管內(nèi)，缺血腦組織不能獲得血氧供給，造成神經(jīng)元的嚴(yán)重缺血而衰亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠缺血區(qū)周?chē)鶨T－β受體表達(dá)的影響及對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行行為學(xué)評(píng)定，探討針康法的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取健康清潔級(jí)雄性Sprague－Dawley大鼠120只，體重(250±30)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按照隨機(jī)數(shù)字表法將120只大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復(fù)組以及針康組，再按腦缺血后的不同分為3天、7天、14天、21天共4個(gè)亞組，每組6只。

1．2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

試劑:兔抗多克隆一抗為武漢博士德和北京博奧森PV6001(北京中山)，其它包括國(guó)產(chǎn)分析純。儀器:美國(guó)moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)，德國(guó)菜卡2135型切片機(jī)，上海一恒電熱恒溫箱，醫(yī)用微波爐、華佗牌針灸針，OSPT－202六道電動(dòng)跑臺(tái)(北京立泰生物科技公司)。

1．3 造模方法

造模前進(jìn)行1周電動(dòng)跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練(速度:10 m/min)，每天訓(xùn)練20 min。模型制備:大鼠造模前禁食不禁水24 h后稱(chēng)重，選用直徑0．20～0．50 mm的強(qiáng)力釣魚(yú)線，剪成長(zhǎng)20 mm的栓線，并將一端修理成光滑球形，以10%水合氯醛(0．3 ml/100 g)行腹腔注射麻醉，將麻醉后大鼠四肢固定，頸部備皮、碘伏消毒后，行正中切口，鈍性分離皮下結(jié)構(gòu)，使頸總動(dòng)脈暴露，同樣暴露迷走神經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。參考Longa EZ方法［6］于頸總動(dòng)脈近分叉處切口，插入與體質(zhì)量相應(yīng)直徑的線栓，收緊備線，線栓沿頸內(nèi)動(dòng)脈推進(jìn)，當(dāng)進(jìn)入約18 mm，可有輕微阻力感，證明線栓頭端已達(dá)大腦中動(dòng)脈處，扎緊備線，縫合，腹腔注射青霉素溶液防止傷口感染，術(shù)后動(dòng)物注意保暖 。術(shù)后6 h參照 Longa EZ［6］的5分法進(jìn)行評(píng)分。0分:無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，即提尾懸空不能伸展左側(cè)前爪;2分:中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:重度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走困難，并向左側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)水平下降。造模成功標(biāo)準(zhǔn):評(píng)分為1～3分，剔除不合格大鼠，隨時(shí)補(bǔ)充模型動(dòng)物以保證每組只數(shù)固定。

1．4 干預(yù)方法

1．4．1 模型組 不予任何干預(yù)，造模后放回籠中，安靜飼養(yǎng)按時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)定。

1．4．2 假手術(shù)組 不予任何干預(yù)，術(shù)后放回籠中，安靜飼養(yǎng)按時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)定

1．4．3 針刺組 造模后24 h僅給予頭穴叢刺干預(yù)，按照“大鼠穴位圖譜”所示，取百會(huì)穴、百會(huì)左右側(cè)旁開(kāi)4 mm處向前或從頂前區(qū)顱中線及左右側(cè)各旁開(kāi)4 mm處向后進(jìn)行針刺(應(yīng)用頭穴叢刺法)，以上針刺區(qū)域覆蓋大鼠頂區(qū)、頂前區(qū)，進(jìn)針后快速捻轉(zhuǎn)1 min后留針3 h。

1．4．4 康復(fù)組 造模24 h后，將大鼠置于不斷向后傳輸?shù)穆膸?，大鼠不斷地在電?dòng)履帶上主動(dòng)向前奔跑，以求避免履帶尾部電柵欄的電擊。運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)訓(xùn)練方案，每天訓(xùn)練20 min，速度:1～3天為5 m/min，4～14 天為 10 m/min，14 天后為15 m/min［7］。

1．4．5 針康組 造模后24 h同步同時(shí)進(jìn)行頭穴叢刺法結(jié)合跑臺(tái)訓(xùn)練，方法同針刺組和康復(fù)組。

1．5 行為學(xué)評(píng)估方法

各組大鼠于造模后3天、7天、14天和21天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組各6只大鼠，進(jìn)行網(wǎng)屏試驗(yàn)，評(píng)估其運(yùn)動(dòng)功能。網(wǎng)屏試驗(yàn):大鼠前爪抓住網(wǎng)屏可達(dá)5 s，且不滑落為0分;大鼠能夠握住網(wǎng)屏，并且滑落一段距離，但未掉下為1分;大鼠在5 s內(nèi)掉下為2分;網(wǎng)屏轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)大鼠即掉下為 3 分［8］。

1．6 標(biāo)本采集及免疫組織化學(xué)染色

1．6．1 標(biāo)本采集 各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定后，將其麻醉且固定于手術(shù)臺(tái)，使其心臟暴露，先后用0．9%生理鹽水及4%多聚甲醛溶液各200 ml心臟灌注，將體內(nèi)血液沖凈(從右房流出的液體變清)，然后斷頭取腦，將腦組織存放入4%多聚甲醛溶液中固定，以備觀察免疫組織化學(xué)。

1．6．2 免疫組織化學(xué)染色 分別經(jīng)過(guò)脫水－透明－浸蠟－包埋－切片－脫蠟－脫水。滴加一抗(ET－β多克隆抗體)，PBS每次沖洗2 min共3次。滴加相應(yīng)二抗，PBS沖洗2 min共3次。DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察效果。

1．7 圖片分析

在高倍鏡(×400)下于梗死灶周?chē)荛_(kāi)白質(zhì)區(qū)神經(jīng)核團(tuán)隨機(jī)選5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)出每個(gè)視野內(nèi)呈現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的ET－β受體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，30個(gè)視野的平均數(shù)代表該標(biāo)本的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較采用單因素方差分析方法，若方差齊，則采用LSD法進(jìn)行分析，若方差不齊，則采用Dunnett法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2．1 運(yùn)動(dòng)功能

假手術(shù)組大鼠麻醉蘇醒后活動(dòng)正常，這說(shuō)明了假手術(shù)本身并未對(duì)大鼠的神經(jīng)功能以及運(yùn)動(dòng)功能造成影響。模型組各時(shí)期運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著高于假手術(shù)組(P＜0．05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。針康組在3天和7天時(shí)評(píng)分與模型組無(wú)顯著性差異(P＞0．05)，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，14天和21天時(shí)評(píng)分低于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定比較

2．2 免疫組織化學(xué)指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果

造模后大鼠腦梗死灶周?chē)鶨T－β受體于3天時(shí)均有表達(dá)，見(jiàn)封三彩圖1(陽(yáng)性表達(dá)呈黃色或棕黃色)，并且分別在3天和7天時(shí)達(dá)到高峰，隨后有不同程度的下降。與模型組相比，假手術(shù)組3天、7天和14天時(shí)有顯著性差異(P＜0．05)，針康組和模型組相比，在3天、7天、和14天均有顯著性差異(P＜0．05);與針刺組和康復(fù)組相比，針康組ET－β受體陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較少，造模后3天和7天均有顯著性差異(P＜0．05)，見(jiàn)封三彩圖2，相對(duì)于其它組別以較快的速度減低;21天時(shí)模型組、康復(fù)組、針刺組、針康組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見(jiàn)表2。

表2 各組缺血區(qū)周?chē)鶨T－β受體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(400×)(ˉx±s)

3 討論

針康法是由唐強(qiáng)教授［1］提出的康復(fù)理念，其方法是采用頭穴叢刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練治療腦卒中。針康法具有雙向調(diào)節(jié)功能，頭穴叢刺的刺激信號(hào)能夠透過(guò)顱骨直接刺激大腦皮質(zhì)，以達(dá)到作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)而改 善患側(cè)運(yùn)動(dòng)功能之目的，頭穴叢刺的同時(shí)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使患側(cè)重復(fù)運(yùn)動(dòng)信號(hào)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)，使遭到破壞的大腦運(yùn)動(dòng)支配區(qū)產(chǎn)生周?chē)鷥?、遠(yuǎn)隔代償，局部功能重組［1］。針灸專(zhuān)家于致順［9］最早提出頭穴叢刺法這一概念，它是一種治療腦梗死的有效方法，又分為七區(qū)劃分法和長(zhǎng)留針?lè)?。在長(zhǎng)留針期間可以進(jìn)行手法行針從而達(dá)到足夠有效刺激量目的。頭穴叢刺達(dá)到足夠的刺激量可透過(guò)顱骨直接對(duì)大腦皮質(zhì)神經(jīng)產(chǎn)生刺激作用，從而改善神經(jīng)細(xì)胞功能［10］，并且可以抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而減緩由凋亡造成的腦損傷［11，12］。康復(fù)療法可以改善腦卒中運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡等功能障礙，出現(xiàn)可塑性變化，使受損的大腦功能得到改善［13］，相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，動(dòng)物跑臺(tái)訓(xùn)練能縮小腦梗死體積，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)［14］。

內(nèi)皮素－B(endothelin－β，ET－β)受體是內(nèi)皮素(endothelins，ETs)的一種特殊的 G 蛋白耦聯(lián)受體［15］。ETs是一種具有強(qiáng)烈血管收縮效應(yīng)的物質(zhì)，是體內(nèi)一種神經(jīng)調(diào)節(jié)因子，起局部激素作用。有研究表明，腦缺血可導(dǎo)致ETs增加并作用于ET－β受體，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放谷氨酸，加重神經(jīng)元退行性變性［16］。Morga等［17］發(fā)現(xiàn)ET－β受體可增加一氧化氮釋放，從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。

為了更接近于臨床康復(fù)中的實(shí)際情況，本實(shí)驗(yàn)各干預(yù)組在介入時(shí)間、單次訓(xùn)練時(shí)間及訓(xùn)練強(qiáng)度由小到大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠pMCAO造模后，針康組、針刺組、康復(fù)組、模型組大鼠半暗區(qū)內(nèi)有大量ET－β受體陽(yáng)性細(xì)胞，以缺血后3天、7天達(dá)高峰，之后總體峰值減低，21天時(shí)基本與假手術(shù)組相當(dāng)。此變化規(guī)律與Morga等［17］發(fā)現(xiàn)一致。針康組大鼠腦梗死灶周?chē)鶨T－β受體表達(dá)較模型組明顯減少，與其它干預(yù)組相比，在3天、7天和14天時(shí)ET－β受體表達(dá)數(shù)目明顯減少(P＜0．05)。在動(dòng)物行為學(xué)評(píng)分發(fā)面，各組不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物行為學(xué)評(píng)分，針康組均低于同期康復(fù)組、針刺組、模型組。本實(shí)驗(yàn)建立了針康法對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)和腦組織ET－β受體表達(dá)的關(guān)系:針康法能夠降低大鼠腦梗死灶周?chē)鶨T－β受體的表達(dá)，并加快其下降的趨勢(shì)，從而有效地緩解血管痙攣，使缺血區(qū)腦組織細(xì)胞及時(shí)得到血流，及早地逆轉(zhuǎn)惡性發(fā)病過(guò)程，并且減少其對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，從而促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)的再生，增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)能力。

綜上所述，本研究表明，相對(duì)于單純的康復(fù)療法，針康法能較好促進(jìn)腦梗死大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，其機(jī)制可能與腦梗死灶周邊區(qū)的ET－β受體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少有關(guān)，其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

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