馬世江 李 靜 靳 玫 李素芳 譚 軍

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 新鄉(xiāng) 453003

近年來研究表明［1］，抑制缺血再灌注損傷（ischemiareperfusion injury，IRI）成為目前治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）［2］和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain－derived neurotrophic factor，BDNF）可以抑制神經(jīng)細胞的凋亡，對腦缺血具有明顯的神經(jīng)保護作用［3］。

本研究選用SD大鼠，采用 McCarthy及謝裕華［4］的星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)方法并在現(xiàn)有實驗條件上稍作改進進行體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，經(jīng)純化、傳代至第三代或第四代細胞用于實驗，在氧糖剝奪（oxygen－glucose deprivation，OGD）處理前實驗組給予100μmol／L的腺苷預(yù)處理，研究其對內(nèi)源性NGF、BDNF表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物出生24h內(nèi)的SD大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量10～12g。

1.2實驗方法將SD大鼠星形膠質(zhì)細胞的分離、消化、培養(yǎng)、鑒定，通過分組處理，隨機分為3組：正常對照組（normal control group）、氧糖剝奪組（OGD group）、腺苷預(yù)處理組（ADO group），每組各3只。正常對照組不進行氧糖剝奪，在氧糖剝奪期及復(fù)氧糖期均更換完全DMEM培養(yǎng)基。OGD組在氧糖剝奪期更換成無糖、無血清DMEM培養(yǎng)基；ADO組在氧糖剝奪前24h給予含100μmol／L腺苷的完全DMEM培養(yǎng)基，氧糖剝奪時更換為無糖、無血清DMEM培養(yǎng)基。觀察氧糖剝奪8h復(fù)氧糖24h后星形膠質(zhì)細胞形態(tài)、檢測細胞培養(yǎng)液中NGF和BDNF的濃度。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法分析所有數(shù)據(jù)采用Prism4.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較均采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OGD后星形膠質(zhì)細胞分泌NGF的變化NGF試劑盒檢測行單因素方差分析見表1。由表1可知，OGD組培養(yǎng)液中NGF活性明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明受到缺氧缺糖損傷后，可刺激NGF表達增加；ADO組與OGD組相比NGF分泌明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明腺苷預(yù)處理可以增加NGF表達。

表1 3組ELISA檢測星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪復(fù)氧復(fù)糖24h細胞NGF含量比較 （s，ng／mL）

表1 3組ELISA檢測星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪復(fù)氧復(fù)糖24h細胞NGF含量比較 （s，ng／mL）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與OGD組比較，★P＜0.05

3 0.043±0.007 OGD模型組 3 0.058±0.006▲ADO預(yù)處理組 3 0.076±0.004正常對照組★▲

2.2 OGD星形膠質(zhì)細胞分泌BDNF的變化通過BDNF試劑盒檢測行單因素方差分析見表2。由表2可知，OGD組培養(yǎng)液中BDNF活性明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明細胞受到缺氧缺糖損傷后，可刺激BDNF表達增加；ADO組與OGD組相比BDNF分泌明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明腺苷預(yù)處理可以增加BDNF的表達。

表2 ELISA檢測星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪復(fù)氧復(fù)糖24h細胞BDNF含量比較 （s，ng／mL）

表2 ELISA檢測星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪復(fù)氧復(fù)糖24h細胞BDNF含量比較 （s，ng／mL）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與OGD組比較，★P＜0.01

3 1.756±0.038 OGD模型組 3 1.960±0.050▲ADO預(yù)處理組 3 2.186±0.074正常對照組★▲

3 討論

改善缺血周圍區(qū)血流供應(yīng)是近幾年國內(nèi)外研究的焦點問題。大量研究表明，在體內(nèi)具有神經(jīng)營養(yǎng)的多種生長因子中，BDNF和NGF是近年來在神經(jīng)再生、損傷修復(fù)領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點。BDNF對受損神經(jīng)系統(tǒng)的再生具有積極促進作用［5］。腦缺血發(fā)生以后，腦神經(jīng)細胞的損傷程度與NGF和BDNF的表達水平密切相關(guān)［6］。二者的表達升高有利于缺血后腦組織損傷的修復(fù)［7］，可以明顯促進缺血后腦神經(jīng)元的存活和生長發(fā)育，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)，并能夠防止受損死亡，促進受損神經(jīng)元再生及分化成熟，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中具有非常重要的作用。

NGF可調(diào)節(jié)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，BDNF可改變神經(jīng)元的活性，機制可能是改變了膽堿能神經(jīng)元的功能，進而對皮質(zhì)的可塑性進行調(diào)節(jié)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損害時，特定的神經(jīng)元、局部的星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞可以迅速表達NGF及受體。缺乏NGF及BDNF軸突就不生長，而應(yīng)用NGF及BDNF能使成熟的受損神經(jīng)元軸突生長，提示NGF及BDNF可以促使軸突克服周圍環(huán)境中阻止因素而進行生長。張燕平研究表明，NGF可以抑制神經(jīng)細胞的凋亡，對腦梗死大鼠具有明顯的神經(jīng)保護作用［5］。

NGF作為第一個被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，是神經(jīng)系統(tǒng)維持正常發(fā)育和功能的必要因素［8］。NGF是一種亞基蛋白組成的靶組織源性細胞因子，營養(yǎng)譜比較廣泛，包括基底節(jié)膽堿能神經(jīng)元、海馬和皮層的神經(jīng)元。NGF對缺血再灌注損傷腦組織有確切的保護和治療作用，機制可能包括：（1）NGF能增強自由基清除劑的活性，對降低神經(jīng)元損傷有重要作用；（2）抵抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性；（3）干擾鈣通道與鈣離子排出系統(tǒng)的表達與活化，穩(wěn)定細胞內(nèi)鈣離子濃度；（4）抑制神經(jīng)元的凋亡；（5）NGF能在神經(jīng)元損傷后的促存活作用過程中，促進受損神經(jīng)細胞功能恢復(fù)，促進神經(jīng)遞質(zhì)的恢復(fù)。NGF對早期神經(jīng)細胞發(fā)育分化的影響主要表現(xiàn)在：（1）促使神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化；（2）促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化。而神經(jīng)膠質(zhì)細胞發(fā)育不僅是神經(jīng)系統(tǒng)整體發(fā)育的一個組成部分，且為神經(jīng)元發(fā)育提供不可缺少的環(huán)境條件。

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中具有神經(jīng)營養(yǎng)和保護作用的主要成員之一，可對抗缺血、缺氧等病理損害保護神經(jīng)元，對發(fā)育中的運動、感覺、交感神經(jīng)元的存活、分化和增殖及防止運動神經(jīng)元的退行性變有促進作用。還具有抗凋亡作用，主要機制為［9］：（1）下調(diào)NMDA受體功能，抑制谷氨酸的毒性；（2）通過誘導(dǎo)鈣結(jié)合蛋白表達，穩(wěn)定細胞內(nèi)Ca2＋濃度；（3）BDNF可以調(diào)節(jié)自由基代謝，從而保護神經(jīng)元免受自由基的攻擊；（4）BDNF可以對抗NO供體的細胞毒性，從而保護神經(jīng)元免受損傷。由此可見，腦缺血損傷后，BDNF的表達上升是通過上述適應(yīng)機體的神經(jīng)元保護機制減少缺血性神經(jīng)元死亡，降低腦缺血損傷后神經(jīng)功能的損傷程度［10］。

綜上所述，NGF和BDNF既有神經(jīng)營養(yǎng)，又有神經(jīng)保護作用，抑制神經(jīng)細胞凋亡。本研究通過星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)、氧糖剝奪、腺苷預(yù)處理已經(jīng)證實：腺苷預(yù)處理后，星形膠質(zhì)細胞損傷減輕，腺苷預(yù)處理組較氧糖剝奪組NGF和BDNF表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。以上實驗結(jié)果表明腺苷預(yù)處理能夠減輕大腦損傷產(chǎn)生腦保護作用，可能與上調(diào)NGF和BDNF表達有關(guān)。局灶性腦缺血后NGF和BDNF表達增高是機體自身的代償反應(yīng)，腺苷預(yù)處理后局灶性腦缺血時NGF和BDNF表達進一步上調(diào)，對機體產(chǎn)生更強的保護作用，我們推斷NGF和BDNF的表達上調(diào)可能是腺苷預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受形成的重要分子機制之一，為腺苷在腦缺血的應(yīng)用提供理論依據(jù)，為臨床治療提供新的途徑。

［1］Xu Z，Xu RX，Liu BS，et al.Time window charaeteristics of cultured rat hippocampal rat hippocampal neurons subjected to ischemia and reperfusion［J］.Chin J Traumatol，2005，8（3）：179－182.

［2］Buckley PF PF，Mahadik S，Pillai A，et al.Neurotrophins and schizophrenia［J］.Schizophr Res，2007，94（1／3）：1－11.

［3］張燕平 .神經(jīng)生長因子對腦梗死大鼠神經(jīng)元凋亡與腦梗死體積的影響［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3（18）：5－6.

［4］謝裕華，易春智，項曉偉，等 .新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，26（3）：277－280.

［5］巴迎春，段艷萍，王金德，等 .內(nèi)源性BDNF促進受損神經(jīng)系統(tǒng)再生的實驗研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2009，40（3）：418－421.

［6］張卓，王廷華，朱榆紅，等.NGF.BDNF和NT3在AD大鼠海馬中的分布及表達變化［J］.四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2005，36（6）：789－791.

［7］李子清，喻凱，趙煥英 .四物湯對血管性癡呆大鼠腦組織中BDNF和EGF的影響［J］.中藥藥理與臨床，2008，24（6）：10－12.

［8］Petruska JC，Mendell LM.The many functions of nerve growth factor：multiple actions on nociceptors［J］.Neurosci Lett，2004，361（1／3）：168－171.

［9］Mizuno T，Kuno R，Nitta A，et al.Protective effects of nicergoline against neuronal cell death induced by activated mincroglia and strocytes［J］.Brain Res，2005，1066（14）：78－85.

［10］張津華，劉其強，白宏英 .尼莫地平對慢性腦缺血大鼠認知和海馬CA1區(qū)NOS亞型的影響［J］.中國實用神經(jīng)疾病雜志，2007，10（5）：74－76.

［11］Ding Y，Li J，Luan X，et al.Exercise pre－conditioning reduces brain damage in ischemic rats that may be associated with regional angiogenesis and cellular overexpression of eurotrophin［J］.Neuroscience，2004，1（24）：583－591.